ДНК и антитела к ДНК

Реакция пассивной гемагглютинации.

Принцип.

Формалинизированные эритроциты барана с присоединенными к их поверхности прочной ковалентной связью ДНК агглютинируют в сывороточной среде с наличием антител к ДНК. В зависимости от конформации молекулы антигена, используемого в реакции (нативная, высокополимерная ДНК, денатурироваиная кипячением в стандартном солевом растворе — ССР, прогретая в присутствии формальдегида), различают 3 типа антител к ДНК. Антитела I типа—к формалинизированной однотяжевой ДНК, антитела II типа — к термоденатурированной ДНК, в которой около 60 % нуклеотидов организовано в спирализованные участки, антитела III типа — антитела к нативной высокополимерной ДНК.

Определение типов антител к ДНК более информативно в клинической практике, так как может быть использовано в целях дифференциальной диагностики.

Реактивы.

1. Препарат нативной ДНК.
2. Препараты ДНК с модифицированной первичной и вторичной структурой. Денатурированную ДНК получают кипячением 50—200 мкг/мл ДНК в стандартном солевом растворе (0,15 М NaCI и 0,015 М раствор трехзамещенного цитрата натрия) в течение 10 мин с последующим охлаждением в ледяной бане. Однотяжевую формалинизированную ДНК получают прогреванием раствора ДНК 400 мкг/мл 10 мин при 100 °С в присутствии 1,3 % формальдегида. Формальдегид взаимодействует с освобождающимися при денатурации аминогруппами азотистых оснований, препятствуя восстановлению разделившихся при нагревании цепей ДНК.
3. Формалинизированные и танированные бараньи эритроциты.
4. Фосфатно-цитратный буфер рН 5,2.

Ход определения.

В лунки полистироловых титровочных пластин разливают 0,9 мл в первую лунку, а в остальные — по 0,4 мл и добавляют 0,1 мл исследуемой сыворотки, предварительно инактивированной при 56 °С 30 мин.

Формалинизация бараньих эритроцитов.

Эритроциты барана отделяют от фибринового сгустка и несколько раз промывают изотоническим раствором натрия хлорида (0,15 М NaCI). 12,5 % взвесь эритроцитов в изотоническом растворе рН 7,0 помещают в сосуд, в который опускают целлофановый мешок, содержащий нейтрализованный формалин,— '/< объема взвеси эритроцитов. Диализ проводят при 4 °С в течение 2 сут и далее при комнатной температуре в течение 2—5 сут против изотонического раствора. Взвесь эритроцитов периодически встряхивают. После окончания диализа эритроциты отмывают в 10-кратном объеме изотонического раствора хлорида натрия с повторным центрифугированием. Отмытые эритроциты суспендируют в равном объеме изотонического раствора. 50 % взвесь эритроцитов при 4 °С сохраняется в течение года.

Обработка эритроцитов танином.

Обработку формалинизированных эритроцитов танином проводят перед их использованием. 2,5 % взвесь формалинизированных эритроцитов с равным объемом танина, растворенного в ССР в соотношении 1:200000. Смесь инкубируют в течение 15 мин при 37 °С, после чего эритроциты отмывают от избытка танина 10-кратным количеством ССР.

Сенсибилизация эритроцитов.

Формалинизированные и танированные эритроциты сенсибилизируют ДНК, денатурированной в присутствии формальдегида. 2,5 % взвесь свежетанированных эритроцитов в фосфатно-цитратном буфере рН 5,2 смешивают с равным объемом ДНК в концентрации 10—20 мкг/мл в том же буфере. Смесь выдерживают в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем .собранные центрифугированием эритроциты отмывают троекратно ССР в разведенной в нем нормальной кроличьей сывороткой, предварительно инактивированной в соотношении 1:250. Приготовленные эритроциты хранят при 4 °С с добавлением 0,4 % раствора формальдегида в ССР с разведенной в нем кроличьей сывороткой. Срок годности — до 4 мес.

В каждом случае перед сенсибилизацией серии эритроцитов необходимо определять количество ДНК, адсорбированной на эритроцитах.

Методика постановки РПГА.

Для постановки используют полистироловые пластины с лунками. В каждую лунку разливают по 0,4 мл, а в первую лунку 0,9 мл ССР и 0,1 мл исследуемой сыворотки. Пассажем из лунки в лунку равных объемов готовят двукратные разведения, после чего во все лунки добавляют по 0,05 мл 2,5 % взвеси эритроцитов, сенсибилизированных ДНК. Пластинки энергично встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 4 ч.

Если эритроциты агглютинируют, то они равномерно устилают все дно лунки. В отсутствие агглютинации эритроциты собираются на самом дне лунки, образуя компактный диск или небольшое кольцо.

В качестве контроля одновременно с той же самой сывороткой при тех же разведениях закапывают формалинизированные эритроциты, не сенсибилизированные ДНК.

Клиническое значение.

Выявление антител к ДНК может служить характеристикой процессов аутоиммунитета. В сочетании с определением типа антител исследователь может оценить активность репаративных процессов, способность организма к адаптивным реакциям (например, нарастание антител к ДНК 1 типа после оперативных вмешательств). Антитела к ДНК I типа широко встречаются как в норме, так и при различных инфекционных процессах (например туберкулезе), вирусных заболеваниях (грипп). Антитела 11 типа, особенно в титрах 1 :160 и выше, отражают активность ревматических болезней. Антитела III типа преобладают при системной красной волчанке и служат дифференциально-диагностическим критерием.

В ряде случаев антитела к ДНК III типа можно выявить при выраженной активности хронического активного гепатита или болезни Шегрена.

Литература.

1. Поверенный А. М. и др.— Вопр. мед. химии, 1966, № 12, с. 117—119.
2. Поверенный А. М. и др.— Вестн. АМН СССР, 1967, № 2, с. 62—64.
3. Белокрчницкчй Д. В. и др.— Вопр. ревмат., 1971, № 12. с. 62—65.
4. Гольдфарб Д. М., Замчук Л. А. Антитела к нуклеиновым кислотам.— М.: Наука, 1975.