Ревматоидный фактор

Унифицированный метод определения реакции гемагглютинации.

Принцип.

Ревматоидный фактор, находящийся в сыворотке крови больных, обладает свойством агглютинировать эритроциты барана, предварительно сенсибилизированные кроличьим иммуноглобулином.

Реактивы.

1. Кроличья гемолитическая сыворотка (амбоцептор). Используют сухую или жидкую прогретую гемолитическую сыворотку с разными титрами, как готовую, так и полученную в лаборатории путем иммунизации кроликов эритроцитами барана.
2. Фосфатно-солевой буфер рН 7,4.
   Перед опытом смешивают раствор А с раствором Б в отношении 1:9, рН раствора доводят до 7,4. Затем одну часть смеси добавляют к 9 частям раствора В.
   1. Натрия фосфат однозамещенный — 24,6 г и до 1 л дистиллированной воды.
   2. Натрия фосфат двузамещенный — 22,4 г и до 1 л дистиллированной воды.
   3. Хлорид натрия — 8,5 г и до 1 л дистиллированной воды.
3. Эритроциты барана:
   1. свежая дефибринированная кровь барана, срок использования до 7 дней, хранение при 2—8 °С;
   2. эритроциты, консервированные в растворе Олсвера; срок хранения до 2 мес при температуре 2—8 °С.
4. Раствор Олсвера: глюкоза — 20,5 г, натрия цитрат — 8 г, лимонная кислота — 0,552 г, хлорид натрия — 4,2 г, дистилли• рованная вода—до 1 л; рН раствора 6,1. Раствор стерилизуют дробно (кипятят на водяной бане 3 дня по 20 мин). Срок хранения до 1 мес при температуре 2—8 °С.

Ход определения.

Подготовительный этап

1. Приготовление 1% и 25% взвеси бараньих эритроцитов: дефибринированную кровь барана или бараньи эритроциты в растворе Олсвера центрифугируют и удаляют надосадочную жидкость. Осадок трижды отмывают 5—6 объемами изотонического раствора хлорида натрия. Надосадочная жидкость при последнем промывании должна быть бесцветной. Из плотного осадка готовят 1 % и 25 % взвесь эритроцитов в фосфатно-солевом буфере рН 7,4.

2. Обработка исследуемой сыворотки: кровь, взятую из локтевой вены больных в количестве 2—3 мл, ставят на 1 ч в термостат. Затем сыворотку отделяют от сгустка (центрифугируют 20 мин при 1000 об/мин, отсасывают надосадочный слой) и инактивируют в водяной бане при 56 °С в течение 30 мин. Хилезные и гемолизированные сыворотки непригодны для исследования.

3. Разведение сывороток: сыворотки больных разводят фосфатно-солевым буфером рН 7,4 в соотношении 1:5 (0,2 мл сыворотки и 0,8 мл буфера).

4. Адсорбция исследуемой сыворотки: проводят с целью устранения гетероагглютининов. 1 мл 25 % взвеси эритроцитов барана центрифугируют 15 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют и к осадку добавляют 0,75 мл исследуемой сыворотки, предварительно разведенной в фосфатно-солевом буфере в соотношении 1:5. Пробирки со смесью встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 1 ч, а затем на 1 ч в холодильнике при 4 °С. После этого центрифугируют 15 мин при 1000 об/мин и осторожно сливают находящуюся сверху надосадочную жидкость. Далее эту надосадочную жидкость, которая является сывороткой в разведении 1:5, используют для приготовления разведении при постановке реакции гемагглютинации в основном опыте.

5. Титрование кроличьей гипериммунной сыворотки (амбоцептор): проводят для определения ее агглютинирующей способности к бараньим эритроцитам. Готовят серию разведении амбоцептора в фосфатно-солевом буфере. Для этого первоначально готовят разведение сыворотки 1:100 (0,1 мл сыворотки и 9,9 мл фосфатно-солевого буфера) и из него готовят дальнейшие разведения:

1:200	- 0,5 мл	гемолитической сыворотки	100	+0,5 мл	фосфатно-солевого буфера
1:300	- 0,5 мл	гемолитической сыворотки	100	+1,0 мл	фосфатно-солевого буфера
1:400	- 0,5 мл	гемолитической сыворотки	100	+1,5 мл	фосфатно-солевого буфера
1:500	- 0,5 мл	гемолитической сыворотки	100	+2,0 мл	фосфатно-солевого буфера
1:600	- 0,5 мл	гемолитической сыворотки	100	+2,5 мл	фосфатно-солевого буфера
1:700	- 0,5 мл	гемолитической сыворотки	100	+3,0 мл	фосфатно-солевого буфера
1:800	- 0,5 мл	гемолитической сыворотки	100	+3,5 мл	фосфатно-солевого буфера
1:900	- 0,5 мл	гемолитической сыворотки	100	+4,0 мл	фосфатно-солевого буфера
1:1000	- 0,5 мл	гемолитической сыворотки	100	+4,5 мл	фосфатно-солевого буфера

Из каждой пробирки с данным разведением переносят в каждую пробирку второго ряда по 0,5 мл сыворотки, затем добавляют равный объем 1 % бараньих эритроцитов (0,5 мл). Пробирки оставляют при комнатной температуре на 15 мин, затем встряхивают и оставляют на 2 ч при 4 °С, после чего учитывают результат. Агглютинационным титром гемолитической сыворотки считается наивысшее ее разведение, при котором происходит агглютинация на 1+.

Для постановки основного опыта используют кроличью гемолитическую сыворотку в разведении 1:4 от концентрации конечного разведения сыворотки, давшего положительную реакцию агглютинации.

6. Приготовление сенсибилизированных эритроцитов: к разведенной кроличьей сыворотке прибавляют равный объем 1 % эритроцитов барана. После тщательного встряхивания смесь оставляют при комнатной температуре на 15 мин; так как при добавлении кроличьей иммунной сыворотки взвесь эритроцитов разводится вдвое, то конечная ее концентрация 0,5 % и ее используют для основной реакции.

Основной опыт (титрование исследуемых сывороток).

1. Готовят последовательные двойные разведения исследуемой сыворотки фосфатно-солевым буфером в объеме 0,2 мл, учитывая исходное разведение 1,5.

2. В каждую пробирку вносят по 0,2 мл 0,5 % сенсибилизированных бараньих эритроцитов. Разведения, схему реакции см. в табл.

3. Таким же образом для контроля ставят реакцию с сывороткой клинически здорового человека и с сывороткой больного с известным высоким титром.

4. Пробирки встряхивают и помещают в холодильник при 4 °С на 18 ч. На другой день оставляют их на полчаса при комнатной температуре и макроскопически учитывают наличие агглютинации. Для обозначения интенсивности агглютинации пользуются системой четырех плюсов. В реакции гемагглютинации определяется конечное разведение исследуемой сыворотки, дающее положительный результат агглютинации на 1 +.

Нормальные величины.

Наличие агглютинации до титра 1:20 считается нормой. Реакция с титром 1:40 и выше — положительная.

Источники ошибок.

1. Плохая консервация эритроцитов барана.
2. Несоблюдение правил при сенсибилизации эритроцитов.
3. Неполная инактивация исследуемой сыворотки.

Литература.

• Иммунохимический анализ. Под ред. Л. А. Зильбера.— М., 1968;
• Методические указания по применению унифицированных клинических лабораторных методов исследований.—М„ 1973, с. 149—153.

 

Унифицированный метод определения
ревматоидного фактора в сыворотке крови
капельной латекс-глобулиновой пробой
(латекс-тест в модификации Сперанского).

Принцип.

Ревматоидный фактор, находящийся в сыворотке больных, обладает свойством вступать в реакцию преципитации с инактивированным человеческим гамма-глобулином, адсорбированным на нейтральных частицах латекса.

Реактивы.

1. Латекс СКИ-3 —полистироловые частицы величиной 0,8 мкм. Срок хранения 1 год. Диагностикум латексовый для обнаружения ревматоидного фактора
2. Гамма-глобулин (готовый препарат 10 % гаммаглобулина). Хранить при 2—8 °С.
3. Глициновоборатный буфер: борная кислота—3,1 г. глицин — 7 г, хлорид натрия — 8,5 г, дистиллированная вода - до 1 л; рН 8,2. Хранить в холодильнике при 2--8 °С. Срок хранения 1 мес.

Ход определения.

Подготовительный этап.

1. Приготовление латекс-глобулинового реагента: 10 % готовый препарат гамма-глобулина инактивируют при 60 °С 15 мин или при 56 °С 30 мин. Затем разводят изотоническим раствором натрия хлорида до 1 % концентрации (I мл 10% гамма-глобулина и 9 мл изотонического раствора).

Латекс разводят в дистиллированной воде из расчета 1:30 (1 мл латекса и 29 мл дистиллированной воды). Полученную взвесь тщательно взбалтывают. К 30 мл суспензии латекса добавляют 24 мл прогретого и разведенного 1 % гамма-глобулина (5 мл латекса и 4 мл гамма-глобулина).

Суспензию латекса и гамма-глобулина щательно смешивают перевертыванием пробирки и оставляют в термостате при температуре 37 °С в течение 30 мин, периодически перемешивая. Затем добавляют 3 мл раствора человеческого альбумина (100 мг сухого альбумина растворяют в 10 мл изотонического раствора хлорида натрия), оставляют на 30 мин при комнатной температуре и на 18 ч в холодильнике, после чего смесь фильтруют через тонкий слой гигроскопической ваты и суспензия готова.

2. Обработка исследуемой сыворотки: кровь, взятую из пальца или из локтевой вены больных в количестве не менее 1 мл, ставят на 1 ч в термостат. Затем сыворотку отделяют от сгустка, '.ентрифугируют 20 мин при 1000 об/мин, осторожно отсасывают сыворотку и инактивируют ее на водяной бане 56 °С в течение 30 мин. Хилезные, гемолизированные и проросшие сыворотки непригодны для использования.

Основной опыт.

Сыворотку исследуемого больного разводят в 20 раз глициновоборатным буфером (0,1 мл цельной сыворотки и 1,9 мл буфера). 0,2 мл разведенной сыворотки наносят на предметное стекло и добавляют пастеровской пипеткой 1 каплю латекс-глобулинового реагента (сенсибилизированной суспензией латекса). После тщательного перемешивания стеклянной палочкой смесь оставляют на 3 мин, затем осторожно покачивают стекло в течение 10—15 с. Окончательный результат учитывают через 5—б мин в проходящем свете от настольной лампы.

Параллельно проводят исследование суспензии латекса со стандартной положительной и отрицательной сыворотками для контроля годности реагентов.

При количественной постановке пробы готовят различные разведения сыворотки—1:20, 1:40, 1:80 и далее. Пробу ставят указанным выше способом.

Оценка результатов реакции.

Реакцию считают положительной, если наблюдается агглютинация частиц латекса. Величину реакции учитывают в плюсах:

++++	все частицы агглютинированы, раствор прозрачен
+++	1/4 частиц агглютинированы, раствор прозрачен по краю;
++	1/2 частиц агглютинирована, раствор мутноватый;
+	слабая агглютинация, раствор мутный

Норма.

Проба положительная при титре 1:20. При положительном результате в более высоких титрах оценка производится согласно титру.

Источники ошибок.

1. Потеря преципитирующей способности частиц при длительном их хранении.
2. Испортившаяся при долгом или неправильном хранении контрольная сыворотка.
3. Грязная, плохо обезжиренная посуда.

Клиническое значение.

Ревматоидный фактор выявляется часто при ревматоидном артрите. Величина титра коррелирует с активностью процесса. В то же время отсутствие ревматоидного фактора в сыворотке не может служить основанием для изменения клинического предположения. Существуют серонегативные формы ревматоидного артрита. «Ревматоидная активность» фактора может быть секвестрирована в иммунных комплексах и быть выявлена после их диссоциации.

Ревматоидный фактор (факторы) может быть выявлен и при других заболеваниях. В высоких титрах он встречается при хроническом активном гепатите, болезни Шегрена, в 30 % случаев подострого бактериального эндокардита, при системных заболеваниях соединительной ткани. Наличие ревматоидного фактора даже в низких титрах может быть информативным при диагностике латентных форм ревматического процесса.

Литература.

1. Механизмы иммунопатологии / Под ред. С. Колна, П. А. Уорда, Р. Т. Мак-Класки.— М.: Медицина, 1983;
2. Сперанский А. И.— В кн.: Материалы докладов на научной сессии, посвященной десятилетию Института ревматизма АМН СССР. М., 1968, с. 75;
3. Цончев В., Попов Н., Коларов С., Каракашов А. Лабораторная диагностика ревматических заболеваний.— София, 1964.