Гемолитическая активность комплемента

Унифицированный метод определения гемолитической активности комплемента по 50 % гемолизу.

Принцип.

Комплемент, содержащийся в исследуемой сыворотке, вызывает гемолиз сенсибилизированных бараньих эритроцитов в присутствии сыворотки кролика, иммунизированного бараньими эритроцитами (гемолитическая сыворотка).

Активность комплемента выражают в гемолитических единицах. За одну 50 % гемолитическую единицу комплемента (CH₅₀) принимают такое его количество, которое вызывает гемолиз 50 % 0,5 мл стандартной суспензии сенсибилизированных эритроцитов при 37 °С за 45 мин. Эта единица условная, величина ее зависит от концентрации бараньих эритроцитов, количества антител, использованных для сенсибилизации, величины рН, ионной силы системы. В связи с тем что присоединение к иммунному комплексу первого компонента комплемента не происходит в отсутствие Ca⁺⁺, а для присоединения 4-го компонента (следующего за активацией C1) необходимо наличие Mg⁺⁺, важно строго соблюдать концентрацию этих веществ в буферных растворах. Необходимо стандартизировать время реакции,температуру.

Реактивы.

1. Гемолитическая сыворотка (гемолизин). Выпускаются стандартные серии препарата в ампулах с титром гемолитической сыворотки, указанным на этикетке. Такие сыворотки имеют длительный срок годности при хранении при температуре 2—8 °С.
2. Эритроциты барана.
3. Веронал-мединаловый буфер.

Состав буфера (в граммах):

• 85 NaCl;
• 5,75- веронал;
• 3,75- мединал;
• 0,22- СаСl₂*2Н₂О;
• 1- Mg₅Cl₂*6H₂O;

pH 7,3—7,8 (5,75 г веронала растворяют в 500 мл горячен дистиллированной воды, смесь охлаждают до +20 °С, добавляют другие компоненты и доводят дистиллированной водой до объема 2 л. Буфер хранят при температуре 3—5°С)

Изначально гемолитическая активность комплемента определялась минимальным количеством сыворотки, вызывающим лизис 100 % определенного количества стандартных эритроцитов. Однако изучение литической активности комплемента в зависимости от его количества выявило сигмовидный характер кривой корреляции, причем полный гемолиз наступает в широкой зоне верхней части кривой, когда сенсибилизированные эритроциты малочувствительны к количественному возрастанию комплемента.

Ход определения.

Подготовительный этап

1. Приготовление буфера: в день постановки опыта к одной части буферного раствора добавить 4 части дистиллированной воды. Разведенный буферный раствор пригоден в течение 12 ч.

2. Обработка исследуемой сыворотки больного: кровь, взятую из вены больного в количестве 2—3 мл, оставляют на 2 ч при комнатной температуре, затем центрифугируют 10—15 мин при 1500 об/мин. Сыворотку осторожно отсасывают и исследование проводят в тот же день.

Приготовление гемолитической системы.

Гемолитическая система — это смесь равных объемов разведенной по троекратному титру гемолитической сыворотки и 3 % взвеси бараньих эритроцитов от объема плотного осадка (100 мл 3 % взвеси и 100 мл разведенной гемолитической сыворотки: 0,1 мл гемолитической сыворотки и 99,9 мл изотонического раствора хлорида натрия).

Приготовление 3 % взвеси бараньих эритроцитов:

дефибринированную кровь барана отмывают 3 раза 5—10-кратными объемами изотонического раствора хлорида натрия, который после третьего отмывания должен быть бесцветным. Из плотного осадка эритроцитов готовят 3 % (по объему) взвесь в изотоническом растворе.

Стандартизация взвеси эритроцитов барана:

Густота взвеси эритроцитов барана оказывает значительное влияние на титр комплемента и поэтому имеет существенное значение. Наиболее точным методом стандартизации эритроцитов является фотометрирование. Используют для этой цели ФЭК М-56.

Методика:

За 15—20 мин до начала исследования включают ФЭК и устанавливают зеленый светофильтр; 1 мл 3 % взвеси отмытых бараньих эритроцитов добавляют в пробирку к 9 мл дистиллированной воды, полученную лизированную кровь вливают в 10-миллиметровую кювету, в другие две кюветы (такого же объема) наливают растворитель, т. е. смесь из 1 мл изотонического раствора и 9 мл дистиллированной воды.
В левый кюветдержатель ставят кювету с растворителем, в правый — кювету с лизированной кровью. Величину оптической плотности раствора отсчитывают по правой части барабана. Определенной концентрации эритроцитов соответствует определенный показатель шкалы оптической плотности. Если 3 % взвесь бараньих эритроцитов приготовлена правильно, то шкала оптической плотности показывает 0,4.
Если показатель оптической плотности менее 0,4, то к приготовленной взвеси следует добавить соответствующее графику количество эритроцитов. Если же показатель оптической плотности выше 0,4, то к приготовленной взвеси бараньих эритроцитов следует прибавить соответствующее количество изотонического раствора хлорида натрия (см. рис.).
После приготовления 3 % взвеси эритроцитов готовят гемолитическую сыворотку.

Разведение гемолитической сыворотки:

Перед опытом ампулу вскрывают, содержащийся в ней лиофильный препарат разводят стерильным изотоническим раствором хлорида натрия согласно инструкции. Гемолитическую сыворотку берут в разведении, которое в 3 раза превышает ее исходную концентрацию. Так, если титр гемолитической сыворотки равен 1:1200, готовят разведение 1:400. Исходя из необходимого для постановки реакции объема гемолитической системы, отмеривают нужное количество гемолитической сыворотки. После этого ампулу запаивают и остаток гемолитической сыворотки сохраняют до следующего опыта в холодильнике при 4—8 °С. Только после приготовления 3 % взвеси бараньих эритроцитов и разведения по титру гемолитической сыворотки можно приступить к приготовлению гемолитической системы.

Смешивание гемолитической сыворотки (0,1 мл и 99,9 мл изотонического раствора натрия хлорида) с эритроцитами производят по возможности быстро, причем гемолитическую сыворотку примешивают к взвеси эритроцитов, а не наоборот. Смесь выдерживают при 37 °С в термостате 30 мин для сенсибилизации эритроцитов.

Титрование комплемента.

Исследуемую сыворотку, разведенную 1:10 буферным .раствором, разливают в 2 пробирки: 0,1 и 0,25 мл. Разлитую сыворотку (1:10) доводят веронал-мединаловым буфером до объема 1,5 мл. Затем в каждую пробирку прибавляют 1,5 мл стандартизированной гемолитической системы.

Одновременно с опытными пробирками ставят контроль на отсутствие гемолиза сенсибилизированных эритроцитов:

1,5 мл гемолитической системы и 1,5 мл веронал-мединалового буфера. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37 °С на 45 мин. После инкубации их охлаждают в рефрижераторе при 2—4 °С в течение 18—19 ч. На следующий день проводят фотометрирование надосадочной жидкости из каждой пробирки (против изотонического раствора хлорида натрия или дистиллированной воды в контрольной кювете колориметра).
Для учета степени гемолиза необходимо использовать шкалу стандартных разведении лизированных эритроцитов по А. П. Конникову, которую готовят для каждой партии эритроцитов и гемолитической сыворотки, как указано:

	№ пробирки
	1	2	3	4	5	6
Гемологическая система разведения вдвое, мл	0,2	0,3	0,4	0,5	0,6	0,7
Дистиллированная вода, мл	0,8	0,7	0,6	0,5	0,4	0,3
Гемолиз, %	20	30	40	50	60	70

Для вычисления 50 % единицы гемолиза строят калибровочную кривую. Контролем служит оптическая плотность пробирки № 4 из шкалы Конникова, которая соответствует 50 % гемолизу. На оси ординат откладывают величину оптической плотности, измеренной на ФЭКе, как контроля, так и исследуемого материала, и проводят горизонталь, параллельную оси абсцисс, до пересечения с перпендикулярами, восстановленными на оси абсцисс в соответствующих 0,1 и 0,25 разведениях сыворотки.

Пример:

пробирка из шкалы Конникова № 4, отражающая 50 % гемолиза, соответствует показаниям ФЭК-13.

Результаты исследования: фотометрирование первой пробирки, которая содержит 0,1 мл сыворотки, показывает 0,07: второй пробирки, содержащей 0,25 мл,—0,12. Соединяют эти две точки и линию соединения продолжают до пересечения с линией 50 % гемолиза. Из точки пересечения опускают перпендикуляр на линию абсцисс, где отмечены показания разведения сыворотки (например 0,25).

Х=1/0.25=100/25=4C_р50

Расчет ведут по формуле: 0,25 мл (1:10) CH₅₀=1 мл.

В связи с тем что 0,25 мл — это испытуемая сыворотка, разведенная 1:10, результат надо умножить на 10, т. е. в 1 мл исследуемой сыворотки будет 40 CH50. В сыворотках здоровых доноров обычно содержится 20—40 гемолитических единиц комплемента. Уровень комплемента у женщин ниже, чем у мужчин, в пределах 10 %.

Литература.

1. Иммунохимический анализ/Под. ред. Л. А. Зильбера. М. 1968,Лабораторная иммунология/Под ред. О. Б. Вязива. М., 1967:
2. Резникова Л. С. Комплемент и его значение в иммунологических реакциях.— М.. 1967;
3. Бойд У. Основы иммунологии.— М.: Мир. 1969;
4. Kabat E.. Mayer М. Experimental Immunochemistry. 2 ed., 1964.