Антигиалуронидаза

Унифицированный метод определения Антигиалуронидазы в сыворотке крови.

Принцип.

Специфические антитела сыворотки больного вступают в реакцию с вносимым в нее антигеном — ферментом гиалуронидазой и ингибируют ее активность, что проявляется в сохранении сгустка муцина, образованного гиалуроновой кислотой в кислой среде.

Посуда и оборудование.

1. Термостат на 37 °С.
2. Пробирки химические.
3. Штативы.

Реактивы.

1. Препарат (лиофилизированный) стрептококковый гиалуронидазы.
2. Гиалуроновая кислота.
   Для приготовления гиалуроновой кислоты используют пупочные канатики новорожденных. Освобожденные от сосудов канатики измельчают до кашицеобразного состояния, взвешивают, заливают двойным объемом дистиллированной воды и помещают на 2—10 ч в холодильник при 3 °С. После этого смесь нагревают, доводят до кипения, фильтруют через стеклянную вату и сохраняют при температуре 3 °С.
   При титровании антигиалуронидазы в крови больных рекомендуется использовать раствор гиалуроновой кислоты с относительной вязкостью, равной 3. С этой целью сопоставляют время истечения дистиллированной воды и раствора гиалуроновой кислоты при температуре 36—37¦°С в вискозиметре Оствальда. Расчет относительной вязкости раствора гиалуроновой кислоты производят следующим образом. Например, время истечения гиалуроновой кислоты равно 27 с, а время истечения воды — 9 с, следовательно, относительная вязкость раствора гиалуроновой кислоты равна 3 (27:9). В том случае, если эта величина больше 3, следует раствор развести дистиллированной водой до нужной вязкости и в качестве рабочей дозы взять 0,3 мл.
   При отсутствии вискозиметра Оствальда за рабочую дозу гиалуроновой кислоты принимают ту дозу, которая при подкислении жидкости уксусной кислотой образует отчетливый сгусток при полном просветлении среды. Рабочая доза гиалуроновой кислоты обычно равна 0,3 мл. В том случае, если рабочая доза гиалуроновой кислоты больше 0,3 мл, она не может быть применена для титрования гиалуронидазы. Определение рабочей дозы гиалуроновой кислоты следует производить перед каждым титрованием гиалуронидазы. При использовании гиалуроновой кислоты, вязкость которой неизвестна, необходимо в каждом опыте в качестве контроля титровать сыворотку с известным титром антигиалуронидазы.
3. Приготовление 15 % раствора уксусной кислоты:
   15 мл ледяной уксусной кислоты х.ч. прибавляют к 85 мл дистиллированной воды.

Ход определения.

Обработка сыворотки больных и крови с растворителем.

При титровании антител можно использовать сыворотку или кровь, смешанную с растворителем.

А. Сыворотка больных: кровь, взятую из пальца или из локтевой вены в количестве не менее 0,5 мл, ставят на  15 мин в термостат, а затем в холодильник. Через 2—4 ч стояния при температуре от 3 до 8 °С сыворотку отделяют от сгустка, прогревают при 56 °С в течение 30 мин и используют для титрования антител. Хилезные, гемолизированные и проросшие сыворотки непригодны для титрования

Разведение сывороток

Сыворотки больных разводят 0,85 % раствором хлорида натрия:

1) 1:50—0,1 мл сыворотки и 4,9 мл 0,85 % хлорида натрия;
2) 1:250—0,5 мл сыворотки, разведенной 1:50, и 2 мл 0,85 % хлорида натрия;
3)1:1000—0,5 мл сыворотки, разведенной 1:250, и 1,5 мл 0,85 % хлорида натрия.

Б. Кровь с растворителем:

• для приготовления растворителя крови к 100 мл дистиллированной воды добавляют 2,05 г глюкозы, 0,16 г нитрата натрия и 0,5 г хлорида натрия рН 6,1— 6,3. После автоклавирования к растворителю крови добавляют мертиолат до концентрации 1:20 000, затем равномерно в стерильных условиях разливают по пробиркам и сохраняют в холодильнике при температуре от 4 до 10 °С
• Кровь в количестве 0,3 мл, взятую из пальца, смешивают с 2,7 мл растворителя (на 0,5 мл крови 4,5 мл растворителя). После тщательного перемешивания разведенную растворителем кровь помещают в холодильник. На следующий день форменные элементы крови (осадок) удаляют центрифугированием, надосадочную жидкость пастеровской пипеткой отсасывают в другую пробирку, прогревают при 56 °С в течение 30 мин, затем пробирки плотно закрывают резиновыми пробками и сохраняют в холодильнике до проведения опыта. Определение антител в малом объеме крови может быть произведено после длительного хранения (в течение 25 дней) крови, разведенной растворителем.

Разведения надосадочной жидкости, полученной из крови с растворителем.

• Все разведения надосадочной жидкости, полученной из крови, предварительно смешанной с растворителем, делают на 0,85 % растворе хлорида натрия. Исходное разведение крови в растворителе 1:10 соответствует разведению сыворотки 1:20.
• Исходя из этого, из надосадочной жидкости готовят следующие разведения:

• 1:50—1 мл надосадочной жидкости и 1,5 мл 0,85 % хлорида натрия;
• 1:250—0,5 мл надосадочной жидкости, разведенной 1:50, и 2 мл 0,85 % хлорида натрия;
• 1:1000—0,5 мл надосадочной жидкости, разведенной 1:250, и 1,5 мл 0,85% хлорида натрия.

Приготовление раствора стрептококковой гиалуронидазы: высушенный лиофильным методом препарат стрептококковой гиалуронидазы перед добавлением в пробирки растворяют в изотоническом растворе натрия хлорида, как это указано на этикетке. Разведенный таким образом препарат должен содержать в объеме 0,2 мл одну опытную дозу, т. е. то количество гиалуронидазы, которое нейтрализуется одной единицей рабочего стандарта антигиалуронидазы ГКИ.

Титрование антител Разведенную сыворотку или разведенную надосадочную жидкость из крови в растворителе и другие ингредиенты разливают по пробиркам (табл.).

Примечание. Общий объем ингредиентов в пробирке равен 1 мл, он слагается из количества сыворотки больного, гиалуронидазы, гиалуроновой кислоты и 0,85 % раствора NaCl.

Результаты титрования обозначают:

• (+)     положительная реакция—сгусток и просветление среды;
• (±)     сомнительная реакция — хлопья и нити;
• (-)      отрицательная реакция — мутная среда без сгустка.

Титр сыворотки выражают числом единиц антигиалуронидазы (AEHyS) в 1 мл сыворотки.

За 1 AEHyS принимают то минимальное количество сыворотки, которое нейтрализует ОДНУ опытную дозу гиалуронидазы.

В табл. приведено число AEHyS в 1 мл при нейтрализации стрептококковой гиалуронидазы различными разведениями сыворотки.

Контроль.

1. Пробирки № 12, 13 служат для контроля гиалуроновой кислоты и гиалуронидазы. Гиалуроновая кислота при учете реакции при подкислении уксусной кислотой должна образовать полный сгусток. Гиалуронидаза должна разрушать гиалуроновую кислоту, которая при этом теряет способность образовывать сгусток при добавлении уксусной кислоты.

2. Для контроля условий опыта используют эталон стрептококковой антигиалуронидазы, 2 ампулы которой вложены в коробку со стрептококковой гиалуронидазой.

Содержимое ампулы с эталоном разводят 1:50, растворяя его в 10 мл изотонического раствора, и титруют одновременно с сыворотками больных (см. табл. 44). Результаты титрования сывороток могут быть учтены, если титр эталона соответствует указанному на этикетке или отклоняется на ± одно разведение. В последующих опытах при отсутствии эталона для контроля можно использовать одну из сывороток больных, титр которой был установлен по эталону.

Унифицированный метод определения антигиалуронидазы  в малом объеме крови.

Принцип.

см. выше

Реактивы.

Растворитель (модифицированный раствор Олсвера -Эйнсли): глюкоза—2,05 г, нитрат натрия — 0.16 г. хлорид натрия — 0.5 г. дистиллированная вида —100 мл, рН 6,1. Раствор автоклавируют, добавляют мертиолат (1:20000) и разливают в пробирки.

Обработка крови больных.

Определенный объем цельной крови больных, взятой из пальца пипеткой, смешивают с растворителем (на 0,1 мл крови 0,9 мл растворителя). После тщательного перемешивания смесь помещают в холодильник при 5-10?С. На следующий день ее центрифугируют и удаляют осадок. Надосадочную жидкость прогревают при 56?С в течение 30 мин.

Исходное разведение крови в растворителе 1:10 соответствует разведению сыворотки 1:20. Дальнейшее разведение сыворотки делают на изотоническом растворе хлорида натрия (cм. раздел «Разведение сывороток»).

Определение антигиалуронидазы.

см. табл.

Оценка полученных результатов.

Титр антигиалуронидазы до 300 единиц (AEHуS) обнаруживают у практически здоровых людей. Активность фермента, не превышающая эти цифры, считается нормой.

Клиническое значение.

Определение титра антигиалуронидазы широко используют в диагностике ревматического процесса. Количественная характеристика антител — их титр — служит критерием активности ревматического процесса. Однако, оценивая этот показатель, необходимо всегда помнить, что уровень антител в крови пациента прямо указывает на состояние иммунореактивных систем и косвенно — на активность патологического процесса. У больных ревматизмом титры антигиалуронидазы достигают 1000 единиц и более. Данные литературы, а также опыт работы лаборатории иммунологии I ММИ им. Сеченова указывают, что больные ревматизмом с высокими функциональными показателями иммунокомпетентных систем хорошо поддаются терапии. Высокие титры противострептококковых антител и в большей степени антигиалуронидазы у больных ревматизмом могут служить показанием к назначению умеренных доз стероидных гормонов. В трудных дифференциально-диагностических случаях, когда необходимо оценить характер лихорадки у больных ревматизмом, значительное повышение титров антигиалуронидазы позволяет врачу склониться в пользу активации ревматизма и применить соответствующую терапевтическую тактику.

Литература.

1. Иоффе В. И. Иммунология ревматизма.—Л., 1962;
2. Лямперт И. М. Серологические методы исследования.— М., 1962; МРТУ-42 № 136-66 на стрептококковую гиалуронидазу. Наставление по применению стрептококковой гиалуронидазы для определения антигиалуронидазы в сыворотках больных.— М., 1966;
3. Сачков В. И., Кузнецова Н. И., Анохин В. Н., Токмачев Ю. К,- Иммунологические методы изучения реактивности при ревматизме.— В кн.: Вопросы ревматизма. М.: Медгиз, 1961, с. 34—48.