С-реактивныи белок

Унифицированный метод кольцепреципнтации в капиллярах.

Принцип.

Сыворотка крови, экссудат или асцитическая жидкость, содержащие белок острой фазы — С-реактивный протеин, образуют хлопьевидный преципитат при взаимодействии со специфической преципитирующей иммунной сывороткой к этому антигену.

Приборы и оборудование.

1. Стеклянные капилляры (комплектуются в наборе с антисывороткой).
2. Штатив — брусок пластилина.

Реактивы.

Антисыворотка к С-реактивному белку

Исследуемый материал.

Сыворотку крови получают обычным путем из 0,5 мл крови. Можно набирать в отдельный капилляр из пальца или уха и отслоившуюся сыворотку отламывать, отбрасывая оставшиеся в другом конце капилляра форменные элементы. Подобный метод мы рекомендуем для получения сыворотки из малых объемов крови при радиальной иммунодиффузии, иммуноэлектрофорезе, методе Оухтерлони и других методах с необходимым объемом исследуемого материала 2—5 мкл. Серозную цереброспинальную жидкость набирают предварительно в пробирку,а из нее в капилляр. Необходимо следить, чтобы жидкость была прозрачной, без примеси крови.

Ход определения.

Постановка реакции.
Стеклянный капилляр берут посередине двумя пальцами и, держа под углом 40—45 °, опускают концом во флакон с антисывороткой, набирая ее на '/з длины капилляра (3 см). Капилляр протирают ватой и опускают тем же концом в исследуемую сыворотку или серозную жидкость (последние набирают также на 1/3 длины капилляра—3 см).

Капилляр протирают ватой (при заполнении капилляра не должно быть воздуха между реагентами). Затем капилляр, заполненный на /з длины, покачивают, перемещая жидкость от одного его конца к другому, вследствие чего реагенты перемешиваются (необходимо произвести 10—12 таких перемещений жидкости).

Перед установлением капилляра в штатив следует наклонить его с тем, чтобы конец, через который набирали сыворотку, был свободен на 15 мм. Затем этот конец капилляра погружают в пластилин так, чтобы уровень жидкости в нем был выше поверхности пластилина на 10 мм (сыворотка находится на воздушном столбике). Чтобы не вылить содержимое капилляра при фиксации, его следует держать горизонтально, а штатив вертикально. Реакция проходит при комнатной температуре. Предварительный учет результата реакции производят через 4 ч, после чего капилляр со штативом оставляют на сутки при комнатной температуре или ставят на то же время в холодильный шкаф (температура от 2 до 8°С).

Через 24 ч производят окончательный учет результата реакции. Выпадение преципитата (хлопья, осадок) в капилляре указывает на наличие С-реактивного белка в исследуемой сыворотке или серозной жидкости.

Оценка реакции.

Наличие преципитата в капилляре высотой 1 мм оценивают одним (+) крестом — реакция слабоположительная; преципитат высотой 2 и 3 мм оценивают соответственно двумя (++) и тремя (+++) тестами — реакция положительная; преципитат высотой 4 мм и более оценивают четырьмя (++++) крестами — реакция резко положительная (количество преципитата учитывают по всему капилляру).

Клиническое значение.

Белок острой фазы неспецифичен для какого-либо определенного заболевания, но характерен для острого воспалительного процесса и может служить признаком активности.

Метод преципитации с 3,5 % раствором полиэтиленгликоля ПЭГ-тест ОП280.

Принцип.

Раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) способен осаждать из сыворотки агрегированные иммунные глобулины и иммунные комплексы. Изменение плотности раствора регистрируется на спектрофотометре при длине волны 250 нм.

Различные концентрации ПЭГ (2,5; 3,5; 7 и даже 10 %) вызывают преципитацию различных по молекулярной массе и размерам иммунных комплексов. Низкие концентрации ПЭГ осаждают комплексы крупных размеров, высокие концентрации вызывают преципитацию низкомолекулярных соединении. 3,5 % ПЭГ флоккулирует наиболее распространенные «промежуточные» комплексы средних размеров.

Посуда и оборудование.

1. Пробирки химические и центрифужные.
2. Пипетки.
3. Центрифуга высокооборотная с ускорением не менее 2000 g.
4. Спектрофотометр.

Реактивы.

1. Буфер боратный 0,1 М, рН 8,4.
2. Полиэтиленгликоль (мол. м. 6000).

Ход определения.

Готовят 7 % раствор полиэтиленгликоля на 0,1 М боратном буфере рН 8,4. 200 мкл исследуемой сыворотки смешивают с 5 мл боратного буфера указанной концентрации; 4 мл этой смеси приливают к 4 мл 7 % раствора полиэтиленгликоля (конечная концентрация 3,5 %). Пробирку ставят в холодильник при 4 °С на 18—20 ч. После инкубации смесь центрифугируют при 2000 g 10 мин. Надосадочную жидкость удаляют. Преципитат дважды отмывают 3,5 % раствором ПЭГ и растворяют затем в 5 мл 0,1 н. раствора едкого натра.

Уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) измеряют на спектрофотометре при 280 нм и выражают в единицах оптической плотности.

Учитывают только те показатели, которые превышают величину X±2S здоровых лиц.