ГЛАВНАЯ СТРАНИЦА ОБЗОР МЕТОДОВ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ НАЗАД
|
|
|
|
ГЛАВНАЯ СТРАНИЦА ОБЗОР МЕТОДОВ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ НАЗАД |
|
Белки исследуемой биологической среды, предварительно разделенные в электрическом поле в соответствии с электрическим зарядом и подвижностью, зависящей от величины заряда, градиента потенциала и свойств среды-носителя, проявляются в реакции преципитации с антисывороткой, содержащей специфические антитела к исследуемым антигенам.
Метод обладает высокой разрешающей способностью, несложен в исполнении. Он позволяет получить представление об относительной концентрации компонентов в системе, определить индивидуальный антиген, не выделяя его из смеси. Изменение физических свойств одного из компонентов, ведущих к отклонениям в иммунологической специфичности, как это наблюдается при гаммапатиях, четко выявляется при использовании иммуноэлектрофоретического анализа.
I.Приготовление агара: предпочтительнее использовать готовый к употреблению очищенный и лиофилизированный бактоагар фирмы «Дифко» (США) или «Серва» (ФРГ). Если таковых нет, можно с успехом применять дальневосточный агар-агар (зарубежные авторы рекомендуют аналогичный дальневосточному японский агар-агар) после предварительной обработки.
Предлагаем несколько способов очистки агара.
Агар предварительно отмывают в проточной водопроводной воде. После этого набухший агар, отжатый от излишков воды, растворяют при 90 °С в дистиллированной воде, добавленной из расчета 10 % (по массе или объему) раствора. К раствору добавляют безводный хлорид кальция из расчета 10 г на 100 г агара для осаждения примесей. Горячий агар фильтруют через капроновое сито или фильтр со стекловатой. После застывания его режут на маленькие блоки и помещают в широкий сосуд, закрытый капроновой сеткой, и ставят на 3 дня под проточную водопроводную воду, а затем в течение 2 дней промывают дистиллированной водой, 5 раз меняя воду, взятую в 1000-кратном объеме к объему блоков. После этого агар вновь расплавляют и фильтруют через капроновое сито. Растворы очищенного агара в буфере с добавлением мертиолата 1:100000 готовят из расчета первоначальной (взятой в обработку) массы или объема агара-сырца. Готовый агар разливают в маленькие флаконы, объем которых достаточен для разового использования, и хранят в холодильнике при температуре от 4 до 6 °С.
В большой сосуд (вместимостью 25 л) помещают около 500 г сухого волокнистого агара и промывают не менее 1 ч проточной водой при 50 °С и столько же времени дистиллированной водой при той же температуре. Затем агар быстро расплавляют на водяной бане так, чтобы получился 3 % раствор в дистиллированной воде. К этому раствору добавляют активированный уголь (1 г на 1 л) и центрифугируют 5 мин при 60 °С. Полученной прозрачной жидкости дают застыть. Гель разрезают на мелкие кусочки и оставляют при — 10 °С до полного замерзания. После оттаивания гель отжимают в марле. Волокнистый отжим отмывают дистиллированной водой и снова отжимают, затем расплавляют и смешивают с равным исходным объемом 0,85 % раствора хлорида натрия. К охлажденному до 65 °С раствору постепенно добавляют горячий спирт до появления осадка (обычно бывает достаточно 1,1 объема спирта). Этот первый осадок после центрифугирования при той же температуре отбрасывают.
Добавляя к надосадочной жидкости 0,2—0,3 объема горячего спирта, получают белый хлопьевидный осадок, хорошо формирующийся при стоянии при 37 °С. Большую часть опалесцирующей надосадочной жидкости удаляют водоструйным насосом, а остаток — центрифугированием. Осадок промывают абсолютным спиртом, сушат при 37 °С и растирают. Получают белый порошок, который хорошо сохраняется в закрытых банках. Подобный порошок очень удобен для приготовления любых концентраций геля, прозрачен, пригоден для разделения крупномолекулярных белков.
II Заливка пластин.
Стеклянные пластины 9Х12 см (можно использовать
фотографические стекла), тщательно вымытые и
обезжиренные, заливают 1 % раствором агара на
вероналовом буфере при 45 °С. Стекла
предварительно укладывают на столик с
горизонтальным уровнем. Для образования слоя
агара толщиной 1 мм на пластину достаточно 10 мл
раствора агара. Для разливки агара удобно
использовать мерную пипетку вместимостью 10 мл,
предварительно прогретую. Для образования
ровного слоя геля, избежания неравномерного его
подсыхания и засорения поверхности стекла с
агаром необходимо закрыть конической крышкой
(чтобы образующийся конденсат не стекал на агар).
III Подготовка
агаровой пластины для проведения
иммуноэлектрофоретического анализа.
Исследуемый материал (сыворотка, моча, лаважная
жидкость, околоплодные воды и т.д.) помещают в
лунки и подвергают электрофоретическому
разделению. По окончании электрофореза вырезают
траншею, куда вносят соответствующую целям
исследования антисыворотку.
Для исследования парапротеинов в сыворотке больных применяют лунки диаметром 2 мм на расстоянии 3 мм от траншеи, ширина которой составляет 2 мм и длина 60 мм. Однако необходимо помнить, что в зависимости от концентрации антигена и титра антител антисыворотки расстояние лунки от траншей может изменяться, его подбирают опытным путем (пробивают ряд лунок от минимального приближения к траншее 1 мм, до максимального удаления — 10 мм). Выбирают то расстояние, которое обеспечило наиболее «контрастный» преципитат.
Лунки пробивают пробойником соответствующего диаметра, а затем агаровую пробу удаляют при помощи водоструйного насоса. Исследуемую сыворотку вносят в лунку пастеровской пипеткой. Наполнение лунки контролируют по исчезновении блика (не переливать!). Заполнение лунки требует определенного навыка. Наличие автоматической пипетки значительно упрощает технику внесения образца и повышает стандартизацию исследования.
Лунки наносят по вертикальной оси стекла, желательно по трафарету, стабилизирующему их положение на стекле относительно полюсов и пробиваемых после проведения электрофореза траншей. Число лунок определяется количеством выявляемых параметров: общая характеристика иммунологической специфичности сывороточных белков с поливалентной антисывороткой, с моноспецифическими антисыворотками к иммуноглобулинам А, М, G, к легким цепям каппа и ламбда.
Электролитные ванны прибора заполняют буферным раствором (катодная и анодная ванны — одинаковым количеством раствора). Перед использованием необходимо проверить рН буфера. Учитывая, что в анодной ванне во время электрофореза происходят интенсивные процессы гидролиза, может меняться рН и ионная сила, необходимо смешивать катодный и анодный растворы по окончании процедуры.
Стекла с агаром и нанесенными образцами соединяют с электродными кюветами при помощи нескольких слоев фильтровальной бумаги. Толщина слоя контактных полос, плотность прилегания бумаги к плоскости агара могут изменять величину силы тока. Наилучшее разделение фракции получают при величине подаваемого на агаровую пластину потенциала 9 В/см по оси электрофореза (1 = 40—50 мА) в течение 3—4 ч. Контроль за скоростью миграции можно осуществлять, наблюдая движение «тени» альбумина при боковом освещении агаровой пластины или используя «свидетель-краситель», скорость движения которого равна скорости миграции альбумина (пиронин).
По окончании электрофореза в агаровой пластине вырезают траншеи в соответствии с трафаретом (размеры траншеи указаны выше) и задачами исследования. Пластины с заполненными антисывороткой траншеями помещают во влажную камеру, в качестве которой удобнее всего использовать эксикатор с небольшим количеством воды. Появление полос преципитации отмечается уже на вторые сутки. Полностью взаимодействие белков, диффундирующих из траншеи с антигенами, расположенными по оси электрофореза, заканчивается на 4—5-е сутки. Достаточно четкие полосы преципитации позволяют анализировать нативные препараты. При необходимости их можно окрасить. Для эффективного окрашивания все белки, не участвующие в специфической реакции, удаляют, промывая пластину в течение 2—3 дней изотоническим раствором, который несколько раз меняют. По окончании промывания гель накрывают смоченной в дистиллированной воде фильтровальной бумагой (можно положить небольшой груз) и оставляют сохнуть при 37 °С или комнатной температуре. Когда гель высыхает и превращается в присохшую к стеклу пленку, бумагу легко удаляют с его поверхности. Высушенную пластину помещают в кювету с красителем следующего состава: амидо-черный В — 1 мл, уксусная кислота — 450 мл, 0,1 М ацетат натрия — 450 мл, глицерин — 100 мл. Окрашивание продолжают в течение 3—4 ч. После этого пластины извлекают и помещают в кюветы с отмывающей жидкостью — 2 % уксусной кислотой, содержащей 10—15 % глицерина. Обработанную подобным образом агаровую пластину легко снимают со стекла и тяереносят на отмытую рентгеновскую пленку. Высыхая, агар полностью сохраняет всю картину преципитации, плотно прилипает к пленке и может быть сфотографирован или сохранен как документ.
Анализ преципитационных дуг проводят в соответствии со схемой постановки, т. е. учета специфичности антисыворотки в траншеях и взаимного их расположения с лунками, содержащими антиген. Примерная схема расположения лунок и траншеи при исследовании парапротеина типа Бенс-Джонса представлена на рис.
При исследовании парапротеинов сыворотки типа О в лунку помещают цельную сыворотку. В траншеи заливают антисыворотки к легкой цепи, соответствующей типу исследуемого G-парапротеина. Образуется так называемая миеломная линия преципитации («ложкообразный» преципитат) с утолщением в одном ограниченном участке, идентичная по форме линии, образующейся с антисывороткой к IgG. Моноклоновость парапротеина и нередко высокая его концентрация обусловливают плотность преципитата и приближенность его к траншее. Чувствительность метода позволяет рано выявлять синтезируемый парапротеин. Низкие начальные концентрации — «Disglobulinemie minima» [Greysel R. et a]., 1958]— могут давать изменение концевого фрагмента дуги в виде утолщения или расщепления.
Схема различных типов преципитатов парапротеина представлена на схеме
При иммуноэлектрофоретическом титровании парапротеинемий другого класса — A, D, Е (которые встречаются крайне редко) — и моноклональных макроглобулинов необходимо исследовать разведенные сыворотки, так как в противном случае линия нормального IgG мешает титрованию.
Особого методического подхода требуют другие источники антигенов, подвергаемые иммуноэлектрофоретическому анализу. Все они, и моча, и промывные воды бронхоальвеолярной системы, и цереброспинальная жидкость и др., как правило (исключение составляет моча, содержащая в ряде случаев нефротического синдрома большие количества белка), имеют низкие концентрации антигенов. Поэтому иммуноэлектрофоретическому анализу должно предшествовать предварительное концентрирование белка в этих жидкостях. Необходимо избирать наиболее щадящий режим концентрации, не изменяющий структуры антигена. Наиболее удобным и приемлемым для любых лабораторий можно считать метод испарения под вентилятором без нагревания. Быстро и эффективно проходит концентрация через полупроницаемую мембрану (диализный целлофан) в среде высокомолекулярного полиэтиленгликоля. При наличии вакуум-насоса применим метод ультрафильтрации через миллипоровые фильтры или диализныи целлофан. Исчисление степени концентрации можно вести по кратности объемов (до и после концентрации). Однако более правильно будет измерение белка в конечном объеме, так как это дает возможность произвести предварительные расчеты разведении антисыворотки в тест-системе. Последняя воспроизводится для каждого типа исследуемого объекта. Так, концентрированная моча исследуется в той же системе, что и сыворотка. Но для лаважной, цереброспинальной жидкости, околоплодных вод и т. д. необходимо в предварительных опытах по раститровке антисыворотки выбрать наиболее оптимальную концентрацию антител. Это достигается при использовании метода двойной иммунодиффузии по Оухтерлони.
Иммуноэлектрофоретический анализ позволяет рано выявить низкие концентрации парапротеина и точно их титровать. Выявление парапротеина позволяет правильно и своевременно поставить диагноз больным и назначить правильную терапию. Титрование легких цепей парапротеинов позволяет дифференцированно применять терапию при амилоидозе, нередко сопутствующем парапротеинемиям. Динамическое наблюдение за концентрацией парапротеина — объективный тест оценки эффективности применяемой стероидной или цитостатической терапии.
