В-лимфоциты

Определение В-клеток методом розеткообра-зования с эрнтроцитами барана в системе ЕАС.

Принцип.

Тимуснезависимые В-лимфоциты имеют на своей мембране специфические детерминанты, позволяющие дифференцировать их от Т-лимфоцитов. Таким детерминантом является поверхностный (мембранный) иммуноглобулин класса М. Число лимфоцитов, несущих иммуноглобулин A, G, Е или D, крайне незначительно (А — 1—5 %, D и Е — 2—4 %), рецепторы для Fc-фрагмента иммуноглобулина G для третьего компонента комплемента (Сз). Выделяют и другие специфические рецепторы, в частности для вируса Эпштейна—Барр, плазмоклеточный антиген, антиген 1а. Однако последние не нашли еще отражения в клинической практике. Чаще применяется метод выявления В-клеток по их способности образовывать розетки с бараньими эритроцитами, нагруженными антителами в среде комплемента. Такие эритроциты маркируют и Fc, и Сз рецепторы В-лимфоцитов.

Приборы и реактивы.

те же, что и для метода определения Т-лимфоцитов. Аналогично готовят и суспензию лимфоцитов.

Антисыворотку, с одержащую антитела к эритроцитам, готовят путем иммунизации кролика эритроцитами барана или быка. Кролику в краевую вену уха вводят 3—5 мл 50 % суспензии эритроцитов. На 4—6-й день у него берут кровь и получают сыворотку, которая в этот период на высоте иммунного ответа преимущественно содержит антитела класса М. Наилучший эффект получают при работе с гамма-глобулиновой фракцией сыворотки, которую получают высаливанием в насыщенном растворе аммиака или риванола. Антисыворотку инактивируют и определяют ее гемолитический и агглютинационный титр.

Можно использовать готовую и широко доступную кроличью гемолитическую сыворотку.

Комплемент.

Источником комплемента служат свежие сыворотки мышей. Беспородных мышей декапитируют, кровь сливают в пробирку, получают сыворотку, которую затем сорбируют пулом человеческих эритроцитов и определяют активность комплемента в гемолитической системе.

Сенсибилизация эритроцитов.

Смешивают равные объемы 1 % взвеси бараньих эритроцитов (предпочтительнее эритроциты быка) и антисыворотки к виду эритроцитов, используемых в реакции (или кроличьей гемолитической сыворотки) в субагглютинирующем разведении. Смесь инкубируют 40 мин при 37°С, осторожно встряхивая каждые 10 мин. После термостатирования эритроциты трижды отмывают фосфатным буфером до 10 мин при 1500 об/мин. Супернатант отбрасывают, а к осадку добавляют первоначальный объем фосфатного буфера и равный объем абсорбированной мышиной сыворотки, содержащей комплемент в разведении 1:10. Смесь помещают в термостат при 37 °С на 30 мин. Вновь эритроциты трижды отмывают. При отмывании их центрифугируют осторожно при 1000 об/мин 5 мин, чтобы не вызвать агглютинации эритроцитов. Готовят 0,5 % суспензию эритроцитов и просматривают под микроскопом. При наличии агглютинации эритроцитов суспензия непригодна. Готовые эритроциты, нагруженные антителами и комплементом (ЕАС), можно хранить в холодильнике (4 °С) 4—5 дней.

Определение ЕАС лимфоцитов.

К 0,1 мл взвеси лимфоцитов добавляют 0,1 мл сенсибилизированных эритроцитов. Оптимальное соотношение эритроцитов к лимфоцитам равно 20 : 1. Смесь инкубируют 45 мин при 37 °С, после чего пробирки помещают в лед. Подсчет В-клеток проводят описанным выше способом (см. «Определение Т-клеток»).

Клиническое значение.

Из рекомендаций ВОЗ определения Т- и В-клеток при различных заболеваниях ясно, что информативность этого вида иммунологического анализа ограничена. Это исследование абсолютно показано при первичных иммунодефицитных состояниях не только для их типирования, но и для дифференцирования от вторичных иммунодефицитных состояний. Диагностическая значимость подсчета Т- и В-лимфоцитов выявлена при идентификации лимфопролиферативных расстройств. Учитывая то обстоятельство, что лимфоциты при различных стрессорных воздействиях под влиянием эндогенных гормонов некоторых лекарственных препаратов мигрируют из периферической крови в лимфоток, лимфоидные органы, рыхлую соединительную ткань, широкое применение исследований Т- и В-клеток крови в клинической практике малообоснованно. Диагностическую ценность несут исследования этих лимфоцитов в синовиальной жидкости при ревматоидном артрите, в моче при верификации определенных форм поражения почек. Очевидна необходимость изучения реакции Т-клеток на различные медикаментозные препараты, используемые в настоящее время клиникой в качестве иммуно-модуляторов, для объективизации их назначения в каждом конкретном случае. Выявление значительного снижения Т-клеток может способствовать утверждению в диагнозе амилоидоза. Можно ожидать, что изучение субпопуляций Т-лимфоцитов, их соотношения друг с другом и в общем пуле лимфоцитов будет более информативно в оценке ряда патологических состояний и эффективности выбранной терапии.

Т-активная субпопуляция представляет собой преимущественно клетки, несущие супрессорную функцию (есть исследования, характеризующие их и как клетки-помощники). Теофил-линчувствительные клетки представлены субпопуляцией супрессоров, а теофиллинустойчивые — клетками-помощниками. Т-клетки, образующие розетки с аутоэритроцитами, как полагают, несут киллерную функцию и играют основную роль в механизмах аутоагрессии.

Изучение динамики эффекторных звеньев клеточного иммунитета отражает активность процесса, помогает'правильно подобрать терапию, уточнить механизмы медикаментозной чувствительности. Но, как правило, эти методы используют для научных исследований.