Выявление мембранных антигенов на мононуклеарах периферической крови и костного мозга с помощью моноклональных антител методом непрямой иммунофлюоресценции (модификация метода Coons et al., 1955)

Непрямая иммунофлюоресценция – метод, основанный на использовании специфичности иммунологической реакции антиген-антитело и чувствительности флюоресцентной микроскопии. При применении этого метода суспензию живых клеток вначале обрабатывают немечеными антителами, специфическими к выявляемому антигену, а затем – флюороохромированными антителами, направленными против специфических антител. Оценка результатов производится по специфическому свечению клеток в люминесцентном микроскопе.

 

Оборудование и принадлежности

1. центрифуга типа “Eppendorf”
2. термостат ТС-80М-2 на 37оС
3. термостат ТС-80М-2 на 56оС
4. холодильник бытовой (+4оС)
5. морозильная камера (-20оС)
6. люминесцентный микроскоп ЛЮМАМ Р-8 или ЛЮМАМ РПО-11
7. счетчик форменных элементов крови
8. автоматическая пипетка с переменным объемом от 0,5 мкл до 10 мкл
9. автоматическая пипетка с переменным объемом от 10 мкл до 1000 мкл
10. наконечники 0,5-10 мкл, 5-300 мкл, 100-1000 мкл
11. микропробирки конические 1,5 мл из полипропилена
12. микропробирки 1,5-2 мл для хранения фасованных реагентов при –20оС
13. контейнеры для хранения фасованных реагентов
14. штативы для микропробирок
15. чашки Петри
16. мерный цилиндр
17. стеклянный стакан на 50 мл
18. стекло предметное (76х26х1,5-2,0 мм)
19. парафилм “M”
20. спиртовка
21. ножницы канцелярские
22. дырокол канцелярский
23. лабораторные маркеры (набор из 5 цветов)

Реагенты

1. специфические антитела
2. флюорохромированные антитела
3. нормальная кроличья сыворотка
4. калий фосфорнокислый однозамещенный
5. натрий фосфорнокислый двузамещенный
6. раствор натрия хлорида 0,9% для инъекций
7. азид натрия
8. глицерин

Подготовительный этап

1. Нормальную кроличью сыворотку (пул сывороток не менее чем от 20 здоровых кроликов) инактивировать в течение 30 мин при 56° С, развести бидистиллированной или деионизированной водой в соотношении 1:10 (1 часть сыворотки и 9 частей воды), расфасовать по 0,5-1 мл в микропробирки, хранить замороженной (-20^оС) до использования.
2. Фосфатно-забуференный физиологический раствор (ЗФФР) 0,1 М рН 7,2-7,4

1. приготовить раствор № 1:
   Na₂HPO₄ ? 12H₂O – 35,8 г на 1 л бидистил.воды*
   
2. приготовить раствор № 2:
   КH₂PO_{4 ?} 2H₂O - 13,6 г на 1 л бидистил.воды
   
3. приготовить концентрированный фосфатно-солевой буфер, рН 7,2-7,4:
   0,2 л раствора №2 постепенно прилить в 0,4 л раствора
   №1, измерить рН и с помощью раствора №1 довести рН до 7,2-7,4
   и добавить азид натрия (конечная концентрация 0,01%), хранить при +4^оС до использования;
   
4. приготовить ЗФФР: взять 100 мл концентрированного фосфатно-солевого буфера
   и добавить 900 мл раствора натрия хлорида 0,9% для   инъекций (использовать в течение 1-2 дней).

3. Специфические и флюороохромированные антитела перед использованием титровать,** хранить при +4^оС и каждый официнальный раствор антител использовать в оптимальной рабочей концентрации.
4. Поли-L-лизин перед использованием титровать (в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя). Рабочий раствор фасовать в микропробирки и хранить при –20^оС до использования. Повторное замораживание не допускается.
5. 30% глицерин готовить из официнального раствора глицерина ч.д.а. и ЗФФР (30 мл глицерина и 70 мл ЗФФР). Хранить при +4^оС до использования.

• *- Соль перед употреблением должна быть высушена в течение не менее 24 часов при 37^оС.
• **- Для каждой новой серии специфических и флюороохромированных антител необходимо подбирать оптимальную рабочую концентрацию. Это можно сделать, обрабатывая клетки, заведомо способные окрашиваться данными антителами, растворами антител разной концентрации (ступенчатое разведение раствора антител в диапазоне, указанном фирмой-изготовителем). Оптимальная концентрация антител
• – это наименьшая концентрация, при которой позитивные клетки еще имеют интенсивное специфическое окрашивание. Эту концентрацию принимают за рабочий титр антител. При несоблюдении этих условий часто можно наблюдать неспецифическое окрашивание клеток.

6. Предметные стекла (76х26х1,5-2,0 мм) не менее чем на 2 часа поместить в смесь Никифорова (1 часть 96^о этилового спирта и 1 часть эфира для наркоза). Парафилм с бумажной основой нарезать прямоугольниками 74х24 мм, сложить их вместе по 4 и дыроколом пробить 8 отверстий таким образом, чтобы между отверстиями было не менее 3 мм. Каждый такой прямоугольник освободить от бумажной основы и, слегка натягивая, наложить на чистое предметное стекло. Парафилм на предметном стекле нагреть над пламенем спиртовки так, чтобы при его расплавлении не образовывались пузыри.

Стекла с парафилмом (каждое отдельно) хранить в алюминевой фольге при комнатной температуре до использования.

7. Влажная камера состоит из чашки Петри, в которую помещают фильтровальную бумагу, смоченную бидистилированной водой и “рельсы” для предметного стекла.

Протокол метода

1. Зарегистрировать перечень реакций по каждому анализу в рабочий журнал, включая положительный и отрицательный контроль. Промаркировать микропробирки.
   
2. Внести 25 мкл суспензии мононуклеаров (3х106/мл) в конические микропробирки.
   
3. Добавить 10 мкл раствора инактивированной кроличьей сыворотки, ресуспендировать клеточную взвесь.
   
4. Инкубировать при 18 – 20оС в течение 20 мин.
   
5. Внести специфические антитела в рабочей концентрации, ресуспендировать клеточную взвесь.
   
6. Инкубировать при 4оС в течение 30 мин.
   
7. Отмыть в ЗФФР 1 раз (центрифугировать при 400 g в течение 5 мин).
   
8. Добавить 10 мкл раствора инактивированной кроличьей сыворотки, ресуспендировать клеточную взвесь.
   
9. Инкубировать при 4оС в течение 5 мин.
   
10. Подготовить предметное стекло с парафилмом ex tempore:
    1. внести 20 мкл поли-L-лизин в лунки из парафилма
       
    2. инкубировать стекло при 37оС в течение 30 мин
       
    3. удалить остатки поли-L-лизина и поместить стекло в стаканчик с ЗФФР до использования (не допускать высыхания).
       
11. Внести 20 мкл флюороохромированных антител, ресуспендировать клеточную взвесь.
    
12. Инкубировать при 4оС в течение 30 мин.
    
13. Отмыть в ЗФФР 2 раза (центрифугировать при 400 g по 5 мин).
    
14. Внести 20 мкл 30% глицерина, тщательно перемешать клеточную взвесь с глицерином.
    
15. Перенести клетки во влажные лунки предметного стекла.
    
16. Инкубировать клетки на стекле во влажной камере при 4оС не менее 30 мин.
    
17. Хранить препараты во влажной камере при 4оС. Допускается хранение препаратов до 6 дней.

Оценка результатов

1. Считать не менее 200 клеток, сопоставляя фазовоконтрастную (световую) и флюоресцентную картину каждого поля зрения, определяя количество клеток, содержащих специфическую флюоресцентную метку:

Следует соблюдать следующий порядок в оценке результатов:

1. Просмотреть и подсчитать клетки в отрицательном и положительном контроле. В положительном контроле все клетки должны экспрессировать общелейкоцитарный маркер CD45. В отрицательном контроле (IgG1 мыши) положительных клеток не должно быть. В случае обнаружения положительных клеток в отрицательном контроле необходимо устранить неспецифическое связывание (Табл.1 в Приложении).
2. При световой микроскопии подсчитать 200 мононуклеаров и среди них, при флюоресцентной микроскопии, определить количество клеток, экспрессирующих моноцитарный маркер (CD14+ клетки).
3. При световой микроскопии подсчитать 200 мононуклеаров и среди них, при флюоресцентной микроскопии, определить количество клеток экспрессирующих антигены МНС класса II (HLA DR+ клетки).
4. При световой микроскопии подсчитать 200 лимфоцитов и среди них, при флюоресцентной микроскопии,* определить количество клеток, экспрессирующих В-клеточные антигены (например, CD19, CD20, CD22).
5. При световой микроскопии подсчитать 200 лимфоцитов и среди них, при флюоресцентной микроскопии, определить количество клеток, экспрессирующих Т-клеточные антигены (например, CD7, CD3, CD4, CD8).
6. При световой микроскопии подсчитать 200 лимфоцитов и среди них, при флюоресцентной микроскопии, определить количество клеток, экспрессирующих маркеры активации (например, CD25, CD38, CD71).
7. При световой микроскопии подсчитать 200 мононуклеаров и среди них, при флюоресцентной микроскопии, определить количество клеток экспрессирующих дополнительные молекулы (например, CD28, CD40, СD54, CD80, CD86, CD95 и т.п.).
8. Записать результаты в рабочий журнал.

 

*- здесь и далее при указании на подсчет в световом поле лимфоцитов, моноциты в счет не включать.

 

Приложение

Таблица 1. Неспецифическое окрашивание и пути его преодоления

Непрямой иммунофлюоресцентный метод
Сильная фоновая флюоресценция	Использовать более высокие разведения специфических или флюорохромированных антител. До нанесения специфических антител предотвратить их неспецифическое связывание нормальной сывороткой животного, донора флюорохромированных антител. Осадить свободный флюоресцеинизоцианат при центрифугировании 400 g.