Цитохимические исследования эритроцитов

Цитохимические исследования отличаются простотой, не требуют специального оборудования и дают ориентировочное представление о количестве исследуемого вещества. Исследования эритроцитов проводят с целью выявления различных внутриклеточных включений, наличия разных форм гемоглобина, ферментных нарушений.

Определение сидероцитов и сидеробластов
Фетальныи гемоглобин
     Метод Бетке
Активность Г-6-ФД

Определение сидероцитов и сидеробластов

Сидероциты и сидеробласты - это эритроциты и эритробласты (нормобласты), содержащие в цитоплазме негемоглобиновое железо в виде гемосидерина и ферритина.

Принцип.

Окраска с помощью реакции на берлинскую лазурь и образование внутриклеточных гранул синего цвета.

Реактивы.

1. 2% раствор железисто-синеродистого калия.
2. 0,1 н. раствор НСl (8,2 мл концентрированной НСl и дистиллированной воды до 1 л).
3. 0,1 % раствор сафранина.
4. Метиловый спирт.

Специальное оборудование.

Микроскоп.

Ход определения.

Фиксируют мазки в метиловом спирте 10—20 мин и высушивают на воздухе. Помещают в смесь равных частей растворов 1 и 2 при температуре 50—56 °С на 15—20 мин. Промывают в проточной воде 10—15 мин и ополаскивают дистиллированной водой. Докрашивают раствором сафранина 3— 5 с.

Нормальные величины.

В периферической крови число сидероцитов не превышает 1,1 % и составляет в среднем 0,6+0,04%, в костном мозге их несколько больше—0,9± +0,09% (в среднем 0,2—2,1%), количество сидеробластов (ядерных эритроцитов с железосодержащими гранулами) в костном мозге 23,7+2,4 %.

Клиническое значение.

Снижение сидероцитов и сидеробластов характерно для железодефицитных анемий. Повышение железосодержащих клеток наблюдается при гемолитических анемиях, гипопластических анемиях, после операции спленэктомии.

Литература.

Цитологические аспекты заболеваний системы крови/Под ред. Э. И. Терентьевой, Г. И. Козинца.— М.: Медицина, 1978, с. 162.

Фетальныи гемоглобин

Метод Бетке

Принцип.

Элюция гемоглобина кислотой с докраской мазков дает возможность отличить эритроциты, содержащие фетальный гемоглобин, по сохраненной окраске в отличие от обесцвеченных эритроцитов, содержащих гемоглобин А.

Реактивы.

1. Цитратно-фосфатный буфер (рН 3,2): 24,7 мл 0,2 М раствора Na₂HPO₄ (35,6 г Na₂HPO₄*2Н₂О и до 1 л дистиллированной воды) и 75,3 мл 0,1 М раствора лимонной кислоты (21,01 г лимонной кислоты и до 1 л дистиллированной воды).
2. 1 % раствор метилового фиолетового или 1 % раствор эозина. Лучшие результаты дает докраска метиловым фиолетовым.
3. Этиловый спирт 80 %.

Специальное оборудование.

1. Микроскоп.
2. Термостат на 37 °С.

Ход определения.

Фиксируют мазки крови в 80 % этиловом спирте 5 мин. Промывают дистиллированной водой и высушивают. Погружают мазки на 5 мин в прогретый при 37 °С в течение 30 мин цитратно-фосфатный буфер (для элюции гемоглобина), периодически помешивая раствор стеклянной палочкой для удаления пузырьков воздуха. Ополаскивают мазки дистиллированной водой, высушивают фильтровальной бумагой. Докрашивают реактивом 2 в течение 2—3 мин. Промывают дистиллированной водой и высушивают.

Нормальные величины.

У взрослых встречаются единичные окрашенные эритроциты (содержащие гемоглобин F); увеличение числа окрашенных эритроцитов наблюдается у новорожденных и детей до 5-месячного возраста.

Клиническое значение.

Увеличение числа эритроцитов с гемоглобином F наблюдается у больных талассемией, особенно при гомозиготной форме.

Литература.

1. Исаева Е. Г., Королева А. М. Лаб. дело, 1965, № 4, с. 201;
2. Betke R., Kleinhauvr Е. Blut, 1958, Bd 5, S. 241.

 

Активность Г-6-ФД

Принцип.

Окисление глюкозо-6-фосфата в присутствии Г-б-ФД при участии NADP, который восстанавливается в NADP-H: под влиянием последнего тетразолии выявляется в виде гранул формазана.

Реактивы.

1. 10% раствор формалина.
2. Инкубационная среда: глюкозо-6-фосфат— 3 мг в 1 мл, NADP — 1 мг в 1 мл, магния хлорид — 0,1 М в 0,2 мл, нитросиний тетразолий — 1 мг в 1 мл, трис-буфер 0,25 М (рН 7,6) — 2,3 мл, феназин-метасульфат — 0,5 мл.

Специальное оборудование.

1. Термостат на 37 °С.
2. Микроскоп.

Ход исследования.

На нефиксированные мазки крови наносят 0,1—0,2 мл инкубационной среды и помещают мазки в горизонтальном положении в термостат на 1 ч 15 мин. Фиксируют в 10 % растворе формалина 10 мин при комнатной температуре. Высушивают на воздухе и микроскопируют.

Нормальные величины.

В эритроцитах обнаруживают 10—20 гранул формазана.

Клиническое значение.

Снижение числа гранул формазана в эритроцитах или их отсутствие указывает на дефицит Г-6-ФД.