Реакция Кумбса.

Принцип.

При наличии неполных (блокирующих) антител на поверхности эритроцитов исследуемого пациента происходит агглютинация эритроцитов при инкубации их с антиглрбулиновой сывороткой (прямой тест Кумбса) или с разведениями сыворотки пациента в реакции с предварительно сенсибилизированными эритроцитами донора (непрямой тест).

Посуда.

1. Пробирки химические.
2. Пастеровские пипетки.
3. Мелкие белые тарелочки.

Реактивы.

1. Раствор 5 % цитрата натрия.
2. 0,9 % раствор хлорида натрия.
3. Антиглобулинювая сыворотка (сыворотка . Кумбса) с титром преципитинов не ниже 1:256— 1:512.

Прямая реакция Кумбса.

Ход определения.

3 мл крови берут из локтевой вены исследуемого в одну пробирку с предварительно внесенным 1 мл 5 % раствора цитрата натрий. Эритроциты трижды отмывают в большом объеме изотонического раствора «атрия хлорида путем центрифугирования при 1500 об/мин, в течение 10 мин. Из отмытых эритроцитов готовят 5 % взвесь на изотоническом растворе (1 капля отмытых эритроцитов и 19 капель изотонического раствора). На сухую частую белую тарелку наносяткапяю антиглобулнновой сыворотки, к ней .добавляют каплю 5 % взвеси эритроцитов исследуемого. Сыворотку перемешивают с эритроцитами стеклянной палочкой. Рядом ставят, контроль, используя вместо сыворотки изотонический раствор. Каждую новую серию антиглобулиновой сыворотки ставят аналогичным путем со стандартными сенсибилизированными эритроцитами и с интактными донорскими эритроцитами различной группы. Перемешанные эритроциты с сывороткой слегка покачивают не более 10 мин.

Учет реакции.

Появление агглютинации указывает на наличие неполных антител на поверхности эритроцитов. Реакция может быть проведена в пробирках. В этом случае 2 капли (0,1 мл) различного разведения антиглобулиновои сыворотки (в зависимости, от титра преципитинов) помещают в пробирки и добавляют каплю отмытых эритроцитов. Осторожно встряхивают и инкубируют 30 мин при 37 °С.

Учет реакции проводят после центрифугирования при 1500 об/мин в течение 1 мин (центрифуга ЦЛК-1).

Непрямая реакция Кумбса.

Ход определения.

Из локтевой вены исследуемого берут 3 мл крови в чистую сухую пробирку.

Реакция идет в два этапа:

1. сенсибилизация стандартных эритроцитов неполными антителами, предположительно находящимися в исследуемой сыворотке;
2. агглютинация сенсибилизированных эритроцитов антиглобулиновои сывороткой.

Необходимо использовать троекратно отмытую в изотоническом растворе смесь эритроцитов различных аллотипов 0(I) группы резусположительных. Каплю этих эритроцитов вносят в пробирку и на них наслаивают 3 капли исследуемой сыворотки. Пробирки энергично встряхивают и помещают в термостат при 37 °С на 40 мин. Параллельно опыту ставят контрольные пробы. Первая: в пробирку с 2 каплями стандартных отмытых резусположительных эритроцитов 0(1) группы вносят 3 капли антирезусной сыворотки АВ (IV); вторая: в пробирку с 2 каплями отмытых стандартных резусотрицательных эритроцитов 0(1) вносят 3 капли сыворотки AB(IV). Контрольные пробирки помещают, так же как и опытные, в термостат при 37 °С на 40 мин.

После термостатирования из пробирок осторожно отсасывают сыворотку. Эритроциты трижды отмывают в изотоническом растворе натрия хлорида. На сухую чистую тарелку наносят в 3 точках по 1 капле антиглобулиновои сыворотки. В первую каплю добавляют эритроциты, сенсибилизированные сывороткой пациента, во вторую и третью — эритроциты контроля 0(I) резусположительных с антирезусной сывороткой AB(IV) и 0(I) резусотрицательные с антирезусной сывороткой AB(IV). Эритроциты тщательно перемешивают стеклянной палочкой с антиглобулиновои сывороткой. После этого осторожно покачивают тарелку в течение 10 мин, но не более.

Учет реакции.

При наличии в сыворотке пациента неполных антител в опытной смеси будет наблюдаться агглютинация. Контроль с резусположительными 0(I) эритроцитами должен дать агглютинацию. В контроле с резусотрицательными 0(I) эритроцитами агглютинации не должно быть. В ряде случаев неполные антитела вступают в реакцию при низкой температуре (4 °С), о чем необходимо помнить в исследованиях при подозрении на холодовую иммунную цитопению.

Клиническое значение.

Выявление антител к эритроцитам играет ведущую роль в диагностике аутоиммунных гемолитических анемий, эссенциальных или вторичных.

При системных заболеваниях (системная красная волчанка, хронический активный гепатит, болезнь Шегрена) бывает чаще положительной непрямая реакция Кумбса.