Антитела к лейкоцитам

При наличии в исследуемой сыворотке антител к лейкоцитам последние образуют агглютинаты, видимые под микроскопом.

Реактивы.

1. Гепарин кристаллический (предпочтительнее) или готовый (во флаконах) раствор.
2. Среда 199 (или фосфатный буфер рН 7,4).
3. 0,35 % и 5 % растворы хлорида натрия.

Ход определения.

Выделение лейкоцитов.

В пробирку с предварительно внесенным раствором гепарина (25 ЕД на. 1 мл крови) из локтевой вены донора вносят 10 мл крови, перемешивают и помещают в термостат при 37 °С в наклонном (45°) положении на 1 ч. После отстаивания плазму с прилегающим к эритроцитам слоем лейкоцитов осторожно отсасывают пастеровской пипеткой и переносят в центрифужную пробирку. После 5 мин центрифугирования при 1000 об/мин надосадочную жидкость удаляют. К клеточному осадку для лизирования примеси эритроцитов добавляют 5 мл 0,35 % раствора NaCI и осторожно ресуспендируют клетки пастеровской пипеткой, не допуская образования пены, в течение 30— 45 с. Вслед за этим немедленно добавляют 0,6 мл 5 % раствора Nad и тщательно перемешивают (раствор становится изотоничным). Полученную взвесь лейкоцитов трижды отмывают средой 199 или фосфатным буфером.

Проводят пробу на жизнеспособность выделенных клеток (см. в разделе «Методы исследования клеточного иммунитета»).

Постановка реакции лейкоагглютинации.

Готовят ряд (кратных двум) разведении исследуемой сыворотки (5—8 пробирок), которую предварительно инактивируют 30 мин при 56 °С. К 0,1 мл (2 капли) сыворотки добавляют по капле взвеси лейкоцитов. Пробирки интенсивно встряхивают и термостатируют в течение полутора часов при 37 °С. После извлечения из термостата пробирки центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин. Надосадок удаляют, а к клеточному слою добавляют 2 капли 3 % уксусной кислоты для удаления примеси эритроцитов и осторожно перемешивают. Каплю клеточной взвеси помещают на предметное стекло и рассматривают под малым увеличением микроскопа.

Учет реакции.

Учет реакции проводят по двум критериям: выраженности агглютинации (интенсивная, т.е. крупные агломераты, значительная площадь свободной жидкости,— 4 плюса; выраженная агглютинация, когда наряду с агломератами лейкоцитов в жидкости можно видеть небольшое количество свободных меток,— 3 плюса; степень агглютинации, при которой среди взвешенных клеток выявляются островки агглютинатов,— 2 плюса и слабая мелкоглыбчатая агглютинация, когда в поле зрения преобладают свободные клетки, но встречаются небольшие комочки склеившихся клеток,— 1 плюс) и величина разведения сыворотки, в которой еще отмечается агглютинация.

Возможные источники ошибок.

Часто встречается неспецифическая агглютинация, особенно при крупноглыбчатой интенсивной реакции. В каждом случае необходимы контроли выделенных лейкоцитов с нормальной совместимой референтной сывороткой. Спонтанная агглютинация наблюдается при высокой концентрации в выделенном клеточном осадке нежизнеспособных лейкоцитов.

Более информативен в клинической практике учет крайних разведении сыворотки с агглютинацией.

Литература.

1. Лимфоциты: выделение, фракционирование и характеристика/Под ред. Дж. Б. Натвича, П. Перлманна, X. Вигзелля.— М.: Медицина, 1980;
2. Руководство по иммунологии/Под ред. О. Е. Вязова и Ш. К. Ходжае-ва.—М.: Медицина, 1973;
3. Тодоров Иордан. Клинические лабораторные исследования в педиатрии.— София, 1963.