ГЛАВНАЯ СТРАНИЦА ОБЗОР МЕТОДОВ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ НАЗАД
|
|
|
|
ГЛАВНАЯ СТРАНИЦА ОБЗОР МЕТОДОВ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ НАЗАД |
|
Если исследуемая сыворотка содержит антитела к антигену стрептококка — стрептолизину-0, то добавление последнего к сыворотке способствует специфическому связыванию антител и отмене феномена гемолиза эритроцитов, добавленных в качестве индикатора реакции к той же сыворотке.
1. Препарат стрептолизина-О.
2. Фосфатный буфер рН 6,5-6,7.
На 1 л дистиллированной воды добавляют 7,4 г NaH(PO4)2;
3,17 г KH2P04:1,81 г К2НРО4*2H2O
и NaOH до рН 6,5—6,7.
Хранить буфер и рефрижераторе при температуре от
3 до 8 °С.
3. Взвесь эритроцитов:
Дефибринированную или взятую с цитратом натрия
кровь кролика или человека (любой группы)
наливают в центрифужные пробирки, отмечают
уровень крови, центрифугируют и удаляют
надосадочную жидкость.
Эритроциты троекратно промывают 0,85 % раствором
NaCI, добавляют до метки 0,85 % раствор NaCl, взвесь
тщательно размешивают и к 5 мл такой взвеси
добавляют 95 мл фосфатного буфера рН 6,5—6,7.
Взвесь эритроцитов готовят в день постановки
опыта.
4. Сыворотка больных:
Кровь, взятую из пальца или локтевой вены в
количестве не менее 0,5 мл, ставят на 15 мин в
термостат при 37°С, а затем в холодильник.
Через 2-24 ч стояния при температуре от 3 до 8 °С
сыворотку отделяют от сгустка, прогревают при 56
°С в течение 30 мин и используют для титрования
антител.
Хилезные, гемолизированные и проросшие
сыворотки непригодны для титрования.
При титровании антител можно использовать
сыворотку или кровь, смешанную с растворителем.
Сыворотки больных разводят фосфатным буфером рН 6.5—6,7. А. 1:50—0,1 мл сыворотки плюс 4,9 мл буфера. Б. 1:250 0,5 мл из разведения 1:50 плюс 2 мл буфера. В 1:1000—0,5 мл из разведения 1:250 плюс 1,5 мл буфера.
Высушенный лиофильным методом стрептолизин-0 непосредственно перед добавлением в пробирки осторожно, не вспенивая, растворяют в фосфатном буфере, рН 6,7—6.5, исходя из.данных указанных на этикетке. Разведенный таким образом препарат стрептолизин-О должен содержать в объеме 0,3 мл одну рабочую дозу, т. е. то количество стрептолизина-О. которое почти полностью нейтрализуется половиной международной единицы антистрептолизина-О стандарта ГИСК.
Разведенную сыворотку или разведенную
надосадочную жидкость из крови в растворителе и
другие ингредиенты разливают по пробиркам, как
это указано в табл.
Результаты титрования обозначают:
+ положительная
реакция отсутствие гемолиза,
в осадке эритроциты;
± сомнительная реакция
частичный гемолиз
- отрицательная
реакция полный гемолиз.
При чтении реакции учитывают последнюю пробирку, в которой сыворотка еще нейтрализует рабочую дозу стрептолизина-О (0,3 мл). Гемолиз эритроцитов в этой пробирке должен отсутствовать. Титр сыворотки выражают числом единиц антистрептолизина-О в 1 мл.
AEST-O — интернациональная единица антистрептолизина-O — равна двум условным единицам антистрептолизина-O, принятым ранее в Советском Союзе.
В таблице. приведено число AEST-O в 1 мл при нейтрализации стрептолизина-O различными разведениями сыворотки.
Пробирки № 12 и 13 служат для конгроля эритроцитов и стрептолизина-О. Эритроциты не должны при учете реакции быть гемолизированы. Стрептолизин-0 в дозе 0,3 мл рабочего разведения должен вызывать полный гемолиз 0,2 мл 5 % взвеси эритроцитов.
После автоклавирования к растворителю добавляют мертиолат натрия до концентрации 1:20000. затем равномерно разливают в стерильных условиях по пробиркам и сохраняют в холодильнике (при температуре от 4 до 8 °С).
Кровь в количестве 0.3 мл, взятую из пальца, смешивают с 2,7 мл растворителя (на 0,5 мл крови 4,5 мл растворителя). После тщательного перемешивания разведенную в растворителе кровь помещают в холодильник. На следующий день форменные элементы крови (осадок) удаляют центрифугированием, надосадочную жидкость пастеровской пипеткой отсасывают в другую пробирку, прогревают при 56 °С в течение 30 мин, затем пробирки плотно закрывают резиновыми пробками и сохраняют в холодильнике до проведения опыта. Определение антител в малом объеме крови может быть произведено после длительного хранения (в течение 25 дней) крови, разведенной в растворителе.
Все разведения посадочной жидкости, полученной из крови, предварительно смешанной с растворителем, делают на фосфатном буфере рН 6,5—6,7. Исходное разведение крови в растворителе 1:10 соответствует разведению сыворотки 1:20.
Разведенную надосадочную жидкость из крови в растворителе и другие ингредиенты разливают по пробиркам, как это указано в табл.
Титр антистрептолизина-O до 250 AEST-O в 1 мл обнаруживается у практически здоровых лиц (титры антистрептолизина-O приведены в интернациональных единицах). В связи с этим титр антител до 250 в 1 мл следует считать в пределах нормы. Повышенные титры антистрептолизина-O обнаруживаются при ряде стрептококковых инфекций (скарлатина, ангина, хронический тонзиллит, ревматизм, гломерулонефрит и др.). Повышение титра этих антител является показателем перенесенной стрептококковой инфекции. Особенно высоких титров достигают эти антитела при ревматизме и нефрите. Характерной особенностью этих двух заболеваний является обнаружение антистрептолизина-O в высоких титрах (500 AEST-O и выше) с первых дней заболевания, что может быть использовано с целью вспомогательного метода диагностики.
Определение антистрептолизина-O имеет особенно большое значение при дифференциации ревматизма от ревматоидного артрита, так как при последнем эти антитела, как правило, обнаруживаются в низких титрах.
Определение антистрептолизина-O может быть использовано для выявления скрыто протекающих форм ревматизма, а также для оценки степени активности ревматического процесса. Определение антистрептолизина-O у больных с целью диагностики ревматизма рекомендуется производить параллельно определению титра антигиалуронидазы. Обычно у больных ревматизмом антигиалуронидаза обнаруживается в высоких титрах (1000 единиц и больше) чаще, чем высокие титры антистрептолизина-0. Однако в некоторых редких случаях, при низких титрах антигиалуронидазы, обнаруживаются высокие титры антистрептолизина-O.
