Иммунные глобулины

Одномерная радиальная иммунодиффузия в агаровом геле для определения иммуноглобулинов.

Принцип.

Антиген, внесенный в лунку агарового слоя, содержащего специфические антитела, диффундируя в агаре, образует кольцо преципитации. Диаметр колец увеличивается до тех пор, пока весь внесенный в лунку антиген не будет связан содержащимися в геле антителами. Величина преципитата отражает количество антител в геле, эквивалентное концентрации антигена, внесенного в лунку. Площадь преципитата, или квадрат диаметра кольца, прямо пропорциональна количеству внесенного в лунку антигена и обратно пропорциональна концентрации антител в агаре. При этом между концентрацией испытуемого антигена и площадью преципитата имеется линейная зависимость. Как показали исследования Mancini и соавт., прямая пропорциональность между площадью преципитата (или квадратом диаметра) и концентрацией антигена устанавливается лишь после прекращения роста колец. Это время различно для разных антигенов и зависит от их молекулярной массы. Так, при одной и той же концентрации рост колец преципитации прекращается для белков Бенс-Джонса через 24 ч, IgG — через неделю, a IgM — через 10 дней.

Уже через 1 ч после начала диффузии можно получить линейную зависимость между диаметром колец преципитации и логарифмом концентрации. Fahey и McKelvey (1965) предложили односуточную инкубацию. В этом случае линейная зависимость устанавливается лишь в небольшом диапазоне концентраций.

Однако использование односуточной инкубации более удобно в практической работе. Поэтому все дальнейшее описание метода радиальной иммунодиффузии относится к этому варианту.

Приборы и оборудование.

1. Стекла 9 X 12 см.
2. П-образная рамка 120Х90Х X 8 мм и толщиной 1 мм для облегчения заливки стекла агаром (при определенном навыке агар можно заливать непосредственно на стекло).
3. Водяная баня на 50—60 °С.
4. Автоматическая пипетка вместимостью 2 мкл или пастеровские пипетки с оттянутым концом.
5. Влажная камера.
6. Измеритель.
7. Миллиметровая линейка.

Реактивы.

1. Моноспецифические сыворотки к иммуноглобулинам А, М и G.

2. 3 % агар, предварительно очищенный в 0,2 М вероналовом буфере, рН 8,56. Навеску 3 г сухого очищенного агара заливают 50 мл дистиллированной воды и ставят на небольшой огонь, постоянно помешивая в течение 40 мин, затем добавляют 50 мл 0,2 М вероналового буфера рН 8,56 и доводят на огне до полного растворения агара (не доводить до кипения!). Добавляют 2 мл 1 % раствора мертиолата.

3. Вероналовый буфер 0,2 М, рН 8,56 (5,52 г веронала растворяют в 300 мл дистиллированной воды, постоянно перемешивая при нагревании, добавляют 35,04 г мединала; дистиллированную воду добавляют до 1 л при охлаждении раствора до 20 °С).

4. Окрашивающая жидкость: амидо-черный — 1 г, ледяная уксусная кислота — 100 мл, дистиллированная вода — до 1000 мл. Профильтровать. 5. Отмывающая жидкость: ледяная уксусная кислота — 70 мл, дистиллированная вода — до 1000 мл.

Ход определения.

Техника постановки опыта.

Титрование антисыворотки и выбор рабочего разведения. Берут две стеклянные пластины 9 Х 12 см, одна из которых смазана гидрофобной жидкостью (например, ГКЖ-94), другая — тонким слоем агара (каплю горячего агара растирают на пластине пипеткой, а пластину прогревают над пламенем). Между этими пластинами устанавливают П-образную рамку толщиной 1 мм и всю систему скрепляют зажимами. Готовят ряд разведении антисывороток на 0,1 М веронал-мединаловом буфере, рН 8,6. Так, для исследования сывороточных иммуноглобулинов разведения выпускаемых в настоящее время антисывороток могут колебаться от 1/10 до 1/60.

Пробирки, содержащие по 1 мл каждого разведения антисыворотки, помещают в водяную баню при 56 °С и добавляют в них по 1 мл растопленного и охлажденного до 56 °С 3 % агара. Смесь агара и антисыворотки хорошо перемешивают и быстро выливают в пространство между пластинами, держа последние под углом так, чтобы в них не попали пузырьки воздуха. Начинают с большего разведения антисыворотки, добавляя каждое последующее разведение после застывания предыдущего. На пластине можно разместить 4 ряда смеси агара с антисывороткой в объеме 2 мл каждое. После застывания последнего ряда агара снимают зажимы, рамку и пластинку, смазанную гидрофобной жидкостью. В каждом ряду, соответствующем разведению антисыворотки, пробойником делают лунки, куда с помощью микрошприца добавляют разведения стандартного препарата в объеме 2 мил. Через сутки инкубации при 4 °С оценивают результаты. Рабочим разведением антисыворотки для каждой системы (для исследования сывороток, секретов и др.) нужно считать максимальное разведение антисыворотки, дающее со стандартом четкие кольца преципитации, интенсивность которых достаточна для их измерения.

Количественное определение иммуноглобулинов в испытуемых препаратах.
Растопленный и нагретый до 56 °С 3 % агар в объеме 4 мл смешивают с равным объемом антисыворотки, разведенной веронал-мединаловым буфером 0,1 М до 1/2 рабочего разведения. Эту смесь в объеме 8 мл заливают в пространство между двумя пластинами, как описано выше (см. <Титрование антисывороток»). Пластины с залитой смесью оставляют на 10 мин при комнатной температуре. После застывания смеси агара с антисывороткой снимают зажимы, рамку и пластину, смазанную гидрофобной жидкостью. На каждой пластине пробойником делают 35 лунок диаметром 2 мм

Приведена концентрация, пригодная для большинства серий агара. Для разных серий необходимая концентрация агара устанавливается эмпирически.

на расстоянии 15 мм друг от друга. Для того чтобы предотвратить деформацию периферических колец, особенно IgM, за счет подсыхания агара и появления эндоосмотических потоков делают по периметру агара дополнительные лунки. Готовят разведения стандарта, меняя пипетки после каждого разведения. Для исследования сывороточных иммуноглобулинов используют стандартную сыворотку (см. ниже), неразведенную и разведенную до 1:2—1:8. В лунки микрошприцем вносят по 2 мкл каждого разведения и испытуемых препаратов. Пластины помещают во влажную камеру и инкубируют сутки при 4 °С. Через 24 ч (ровно!) пластины погружают в забуференный изотонический раствор натрия хлорида и отмывают от несвязавшихся белков в течение 2 сут с троекратной сменой буфера. Затем пластины сушат под фильтровальной бумагой и окрашивают амидо-черным. Учет результатов возможен в неокрашенных пластинах на темном поле с косым освещением, при этом используют для измерения препаратоводитель с нониусом, позволяющим измерять диаметр с точностью до 0,1 мм.

Определив диаметр колец преципитации в стандартном препарате с известным уровнем иммуноглобулинов, строят кривую на полулогарифмической бумаге, где на оси ординат откладывают концентрацию иммуноглобулинов, а на оси абсцисс — диаметр колец. Такую кривую строят для каждой пластины. Далее, измерив диаметр колец в испытуемом препарате, определяют по стандартной кривой концентрацию иммуноглобулинов в этом препарате.

Чувствительность метода.

Чувствительность метода характеризуется тем минимальным количеством антигена, который достаточен для образования измеримого диска преципитации. Это количество различно для разных белков и зависит от молекулярной массы антигена. Поданным Манчини, для альбумина таким пределом является 1,25 мкг/мл. По данным Е. В. Чернохвостовой, при использовании варианта с односуточной инкубацией предельной концентрацией для IgG и IgA является 40— 50 мкг/мл, для IgM — 150 мкг/мл. Вместе с тем пределы чувствительности метода радиальной иммунодиффузии в геле можно расширить, увеличивая диаметр колец преципитации. С этой целью можно пользоваться вместо агара 0,8 % агарозой или ацетат-целлюлозой. Наиболее простым и распространенным методом является разведение антисыворотки, поскольку при разведении антисыворотки увеличивается площадь геля, содержащего антитела, которые необходимы для связывания данного количества антигена, т. е. увеличивается размер преципитата.

Разведение антисыворотки	Диаметр колец исследуемого препарата, мм
1:4	9,3
1:8	10,1
1:16	11,2

Однако с разведением антисыворотки уменьшается плотность преципитата и необходимы дополнительные изменения методики для того, чтобы этот преципитат можно было измерить. Так, можно усилить интенсивность колец окрашиванием их амидо-черным или нигрозином с ледяной уксусной кислотой. Плотность преципитата можно повысить также с помощью ряда копреципитирующих факторов. Например, нормальная кроличья сыворотка, используемая вместо буфера для разведения антисыворотки, будет включаться в комплекс антиген — антитело, усиливая плотность преципитата. Аналогичный эффект оказывает дополнительная обработка пластин антиглобулиновой сывороткой: пластины после инкубации и отмывки погружают в раствор антисыворотки, содержащей антитела к глобулину сыворотки, включенной в агар; спустя сутки кольца преципитации можно увидеть в неокрашенных пластинах.

Наиболее эффективным способом повышения чувствительности метода радиальной иммунодиффузии является использование меченной ¹³¹I антисыворотки. В этом случае агар можно смешивать с антисывороткой, меченной ¹³¹I в таком разведении, что кольца преципитации визуально не обнаруживаются, учет результатов возможен лишь при авторадиографии. Возможна и другая модификация этого метода — обычная постановка радиальной иммунодиффузии со столь высокими разведениями антисыворотки, что кольца преципитации визуально не выявляются. Последующая обработка такой пластины, меченной ¹³¹I антисывороткой к глобулину сыворотки, включенной в агар, и авторадиография повышают чувствительность реакции в 32— 64 раза.

Воспроизводимость метода радиальной иммунодиффузии определяется длительностью инкубации и наклоном стандартной кривой. Если результаты учитывают после прекращения роста колец, когда между всеми концентрациями антигена и площадью соответствующих им преципитатов устанавливается линейная зависимость, то ошибка метода составляет 2 %. При более короткой инкубации, когда линейная зависимость между концентрацией антигена и диаметром колец устанавливается лишь в небольшом диапазоне концентраций, ошибка метода увеличивается до 10 %. При этом в зависимости от природы антигена и концентрации антисыворотки меняется наклон стандартной кривой, что также отражается на воспроизводимости метода. При определении IgM, дающего наименьшие кольца преципитации и наиболее крутую стандартную кривую по сравнению с другими иммуноглобулинами, ошибка определения составляет 13 %, а при определении lgG — 10 %.

Стандарт и требования к нему.

Одним из важных условий количественного определения иммуноглобулинов является правильный выбор стандарта, по которому строится калибровочная кривая. Такой стандарт должен быть единым, чтобы можно было сравнивать результаты, полученные в разных лабораториях.

Использование очищенных иммуноглобулинов в качестве такого референс-препарата нецелесообразно, во-первых, потому, что очищенные белки менее стабильны при хранении и, во-вторых, потому, что при выделении иммуноглобулинов возможны изменения их структуры (расщепление, агрегирование и т. п.) и, следовательно, антигенных и диффузионных свойств. Нежелательно также использовать в качестве стандарта сыворотки больных парапротеинемическими ретикулезами, так как содержащиеся в таких сыворотках IgG и IgM структурно отличаются от нормальных иммуноглобулинов. Наиболее целесообразно использовать в качестве стандарта нормальную человеческую сыворотку или плазму.

Отделение биологической стандартизации Национального института по медицинским исследованиям в Лондоне выпустило такой стандарт. Он представляет собой плазму 465 здоровых взрослых мужчин-доноров, проживающих в Англии. Часть этого препарата была использована ВОЗ как международный стандарт иммуноглобулинов G, А, М человека.

В России стандартная сыворотка для количественного определения иммуноглобулинов методом радиальной иммунодиффузии выпускается Институтом эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи (Москва) и Горьковским институтом эпидемиологии и микробиологии (табл.1 и 2).

Выпускаемые стандарты следует использовать как референс-препараты для калибровки собственного рабочего стандарта, в качестве которого может быть использована любая смесь свежих сывороток от здоровых доноров. Рабочий стандарт следует сохранять при низкой температуре (—20 °С и ниже) либо в лиофилизированном состоянии.

Клиническое значение.

Относительная простота исполнения, доступность реактивов способствовали широкому внедрению метода в клиническую практику. Однако данные литературы и наш собственный опыт работы этим методом с сыворотками самых различных больных в течение более 10 лет позволяют рекомендовать ограничение применения этого метода довольно узким спектром нозологических форм. В первую очередь речь идет о диагностике заболеваний, сопровождающихся синтезом моноклоновых парапротеинов. Метод радиальной иммунодиффузии выступает в данной ситуации скрининговым методом, представляющим патологическую сыворотку для детального анализа в иммуноэлектрофорезе и др. Высока диагностическая информативность метода в оценке первичных и вторичных иммунодефицитов, проявляющихся блокированием синтеза или врожденным отсутствием отдельных классов иммуноглобулинов или их всех — тип Брютона. Высокое содержание сывороточных иммуноглобулинов А, М, G наблюдается при системной красной волчанке, болезни Шегрена, хроническом активном гепатите, ювенильном ревматоидном артрите. Причину повышения уровня иммуноглобулинов отдельных классов в каждом конкретном случае необходимо анализировать отдельно и редко можно связать с определенным заболеванием; например, повышение уровня IgA патогномонично для особой формы геморрагического нефрита, при поражениях печени алкогольной природы, неспецифическом язвенном колите. Высокие значения IgM характерны для ревматоидного артрита, особенно в начальном, трудно1<для диагностики, периоде заболевания, при обострении системной красной волчанки.

При некоторых заболеваниях повышение уровня IgM сопутствует хронизации процесса. Уровень сывороточного IgG колеблется в очень широких пределах при разных заболеваниях. Повышение его чаще сопутствует активности процесса. В клинической практике интерпретация результатов исследования иммуноглобулинов должна осуществляться в комплексе с клиническими данными, результатами других иммунологических показателей.

Определение иммуноглобулинов в других, нежели сыворотка, биологических жидкостях имеет большую диагностическую информативность. Уровень иммуноглобулинов мочи позволяет быть более объективным в оценке активности почечного процесса и глубины поражения клубочкового аппарата. Появление IgM в моче крайне редко и наблюдалось только в тяжелых случаях волчаночной нефропатии и при амилоидозе. Содержание иммуноглобулинов в бронхоальвеолярной жидкости при фиброзирующем альвеолите коррелирует с глубиной морфологических изменений альвеолярной мембраны. Уровень IgG в желчи позволяет дифференцировать воспалительные заболевания желчевыводящих путей. Большую роль в диагностике заболеваний женской половой сферы, изучении причин бесплодия играет характеристика иммуноглобулинов в шеечном секрете (шеечный фактор).

Литература.

1. Малкина Л. А., Шаханина К.Л.— Журн. микробиол., 1975, № 3, с. 33;
2. Стефани Д. В. Иммунология детского возраста.—М., 1981;
3. Чернохвостова Е. В. Количественное определение иммуноглобулинов методом радиальной иммунодиффузии в геле: Методические рекомендации.— М., 1975;
4. Fahey I., McKelvey Е. J. Immunology, 1965, vol. 94, p. 84— 102.

Содержание иммуноглобулинов в стандартных препаратах ВОЗ и Института эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи

	IgG		IgM		IgA
	МЕ/мл	мг/мл1	МЕ/мл	МГ/МЛ'	МЕ/мл	мг/мл1
ВОЗ (67/97)	96,2	8,04	93,5	1,42	96,2	0,85
Институт им. Гамалея	143,5	11,52	126,6	1,8	144,0	1.2
Уровень иммуноглобулинов в весовых единицах — средний уровень, полученный в 10 лабораториях с разными реферанс-антигенами. Уровень иммуноглобулинов в стандарте Института им. Н. Ф. Гамалеи получен при сравнении со стандартом ВОЗ.