ГЛАВНАЯ СТРАНИЦА ОБЗОР МЕТОДОВ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ НАЗАД
|
|
|
|
ГЛАВНАЯ СТРАНИЦА ОБЗОР МЕТОДОВ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ НАЗАД |
|
| Метод иммуноэлектрофореза в среде, содержащей антитела. |
| Принцип |
| Посуда и оборудование |
| Реактивы |
| Ход исследования |
| Клиническое значение |
| Литература |
Антиген, помещенный в среду агара с антисывороткой, образует преципитат, который под действием электрического потенциала образует петлю (ракетку), вытянутую по оси электрофореза. Метод практически совмещает в себе описанную выше радиальную иммунодиффузию и электрофорез. Величина петли преципитата находится в линейной зависимости от эквивалентной концентрации антигена, связанных антител и градиента потенциала. Если последняя величина постоянна, то первая может отражать концентрацию внесенного в агар антигена.
1% (по объему или по массе) раствор агарозы на барбиталовом буфере растворяют при подогревании на кипящей водяной бане, а затем охлаждают до 45 °С. Предварительно выбранное количество антисыворотки (титрование антисыворотки проводят аналогично описанной процедуре в иммуноэлектрофорезе) тщательно смешивают с раствором агарозы и заливают между двумя стеклянными пластинами с помещенной между ними П-образной рамкой (см. выше). Заливка агарозы и формирование слоя происходит более успешно, если форму и пипетку, которой заливают смесь агарозы с антисывороткой, предварительно нагревают до 40—45 °С. Дают остыть форме при комнатной температуре, а затем осторожно снимают верхнее стекло. По линии перпендикулярной оси электрофореза параллельно длинной стороне стекла наносят ряд лунок на расстоянии не менее 2 см между рядами. Центры соседних лунок не должны быть ближе 8 мм. При таких условиях на стекло можно поместить 24 лунки. В средние лунки вносят разведения стандарта (требования к стандарту и его разведениям см. выше), используемые для построения калибровочной кривой. Антиген вносят автоматической пипеткой или микропипеткой в количестве 10 мкл. Подготовленные таким образом пластины помещают на поверхности столика прибора для электрофореза. Стекла с агарозой соединяют с электродными кюветами агарозными пленками с шириной, равной ширине стекла, и толщиной 3 мм. Можно применять и соединительные полоски из фильтровальной бумаги. Во избежание подсыхания и деформации геля в месте соединения с бумажными полосами последние перед соединением их с пластинами смачивают в буферном растворе. Электрофорез ведут при потенциале 10 В/см в течение 2—10 ч в зависимости от характеристик и количества антигена, взятого в определенном отношении к используемой антисыворотке. Если этот метод применяется для определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях с исходно низкой концентрацией антигена (цереброспинальная жидкость, промывные воды бронхоальвеолярной системы), обычно достаточно 2 ч. Электрофорез предпочтительно проводить при внешней температуре 4 °С (в холодильнике или холодной комнате). Время проведения процедуры лимитируется также высотой образующихся при реакции пиков.
После электрофореза гелевые пластины на стеклах отмывают в 0,2 М растворе хлорида натрия в течение суток. Затем высушивают и окрашивают, как это описано выше.
Пики максимальной миграции комплексов антиген—антитело измеряют миллиметровой линейкой. Ошибка измерения не должна превышать 0,2 мм при высоте пиков от 2 до 5 см. Стандартную кривую строят на соотношении величины пиков и концентраций белка в разведениях стандартов антигена обычным путем.
Метод может быть рекомендован для определения низких концентраций антигена в таких биологических жидкостях, как моча, цереброспинальная, бронхоальвеолярная жидкость, слюна и т. д. Высокая чувствительность и воспроизводимость метода дают основания для более широкого использования его в клинико-иммунологическом анализе.
