Возможные источники ошибок и неспецифические реакции при использовании иммунодиффузионных методов

Качественные и количественные результаты иммунодиффузионных методов прежде всего зависят от профессионального мастерства исследователя. Тем не менее ряд объективных факторов, которые необходимо знать и учитывать при критическом анализе результатов, могут вызывать определенные отклонения.

Все варианты методов указанной группы требуют использования тщательно сбалансированной системы по отношению антигена и антител. Низкая концентрация антигенов вызывает смешение преципитата к лунке с антигеном вплоть до полного слияния его с краем отверстия и невозможностью определения при двойной иммунодиффузии в геле. Аналогичная картина может наблюдаться при избытке антител (преципитат сливается с краем лунки, содержащей антитела). Число молекул антител, которое соединяется с молекулами антигена, называют эквивалентным количеством. Хейдельберг и Кендалл впервые определили это количество на основании опытов преципитации в пробирке как количество антигена, которое присоединяется к определенному количеству антител с образованием максимального количества преципитата. Необходимо знать, что при использовании количественных методов иммуноэлектрофореза в ходе реакции все увеличивающееся число молекул антител присоединяется к молекулам антигенов, образуя преципитат, который уже не продвигается в геле в ходе электрофореза. Количество антител, приводящее к преципитации в ходе иммуноэлектрофореза. меньше, чем эквивалентное количество антител, установленное по преципитации в пробирках. Следовательно, иммунные комплексы в преципитате должны быть относительно ненасыщены антителами. При дальнейшем ведении электрофореза уже образовавшиеся преципитаты остаются в геле и становятся все отчетливее по мере того, как соответствующее число молекул антител мигрирует к области преципитации из окружающего геля. Таким образом, при подборе в каждом конкретном случае соотношения в системе антиген—антитело необходимо использовать условия (характеристики электрического поля, среда, время преципитации), которые будут в дальнейшем применены в основном опыте.

Ложноотрицательные реакции могут наблюдаться в системе с избытком антигена — образование растворимых комплексов. При несбалансированном отношении антиген—антитело возможно образование нескольких полос преципитации или ложных «шпор», что затрудняет интерпретацию результатов в методе двойной иммунодиффузии.

Необходимо учитывать молекулярную массу и размер белковых субстратов, включаемых в реакцию, так как эти параметры оказывают значительное влияние на скорость диффузии и электрофоретической подвижности в гелях. Белки с молекулярной массой свыше 200000 медленно диффундируют в агаре. Иммунный глобулин М, a2-макроглобулин, a2-липопротеин и фибриноген обладают и более низкой электрофоретической подвижностью.

Неправильная обработка сыворотки может приводить к агрегации белков и образованию крупномолекулярных агрегатов, например агрегированного IgG. Значительно меняется диффузия сыворотки, содержащей иммунные комплексы, особенно IgM с IgG. При исследовании парапротеинов могут наблюдаться двойные кольца преципитации вследствие общности антигенных характеристик легких цепей парапротеина и нормального иммуноглобулина антисыворотки.

При наличии в исследуемом материале мономерной формы можно наблюдать размытое большое кольцо диффузии без четкого кольца преципитации.

Необходимо учитывать воздействие физических и медикаментозных факторов, которые могут изменять диффузионные свойства и электрофоретическую подвижность. Так, рентгеновское или радиоактивное облучение, длительная терапия высокими дозами кортикостероидов могут вызывать расщепление белков на субъединицы с различными молекулярными размерами и массой, но с идентичными иммунологическими свойствами. Это приводит к появлению артефактов, которые могут быть неправильно интерпретированы («ложные парапротеины») .

Большое внимание необходимо уделять знанию качеств среды, применяемой для иммунодиффузии или иммуноэлектрофореза в соответствии с теми задачами, которые стоят перед исследователем. Плохая очистка геля может служить причиной электростатического взаимодействия антигенов с некоторыми ионизированными группами геля, антигены могут образовывать преципитаты в плохо очищенном геле, которые могут быть приняты за специфические. Исследователь должен творчески подходить к оценке деталей исполнения метода. Так, при изучении высокомолекулярных антигенов с большим размером молекулы, например определение высокополимерной ДНК в плазме методом встречного иммуноэлектроосмофореза, правильнее использовать агарозный гель с концентрацией его в буфере 0,7—0,8 %. Наоборот, применяя стандартный метод радиальной иммунодиффузии для количественной оценки секреторного компонента IgAS, можно допустить применение более плотных гелей, с которыми проще работать и к очистке которых предъявляются меньшие требования.

Все иммунопреципитационные методы анализа антигенов требуют тщательного подбора антисывороток. Налаживание промышленного производства гибридомных сывороток значительно повысит специфичность реакции. Все выпускаемые в настоящее время моноклоновые и очищенные сыворотки требуют обязательного контроля специфичности (особенно это касается люминесцирующих антисывороток к иммунным глобулинам, к альфа-фетопротеину и др.). При работе с каждой партией антисывороток необходимо определять концентрацию антител. Имеет значение вид животного, использованного в качестве объекта иммунизации (кролик, лошадь, коза, свинья и т.д.). Наиболее удобны для практической работы в потоковых методах козьи и кроличьи антисыворотки. Лошадиная антисыворотка может быть причиной удвоения полос преципитации.

При использовании этой антисыворотки часто наблюдается растворение уже сформировавшегося преципитата как в избытке антигена, так и антител (т. е. эта антисыворотка требует очень тщательного подбора эквивалентных концентраций). В редких случаях может иметь место преципитация неиммунной природы.

Такие преципитаты часто растворяются в 10 % растворе хлористого натрия в отличие от устойчивого к этой обработке иммунного преципитата.