Иммунофлюоресцентный метод определения антиядерных антител.

Принцип метода.

Тиоизоцианат флюоресцеина или производные родамина (чаще всего применяемые метки), конъюгированные с антителами, под действием ультрафиолета светятся желто-зеленым или оранжево-красным светом, указывая на расположение антигена, с которым специфически связались меченые антитела.

Существуют два основных варианта метода Кунса: прямой, когда метится непосредственно g-глобулиновая фракция антисывороток (т. е. антитела), и непрямой, в котором используется промежуточная инкубация среза с немеченой антисывороткой (или антителами, предположительно находящимися в исследуемой сыворотке) и последующим проявлением образовавшегося комплекса антигаммаглобулиновой меченой сывороткой другого животного.

Непрямой метод более чувствителен и более применим в условиях клинических исследований. Однако он сопровождается повышением неспецифической адсорбции белков и поэтому требует обязательной постановки контролей.

Антинуклеарный фактор (АНФ) определяется методом иммунофлюоресценции на криостатных срезах печени крыс или мышей. Антитела к различным антигенам клеточного ядра — ДНК, нуклеогистону, рибосомам, нуклеолам, находящиеся в исследуемой сыворотке, вступают в специфическое связывание с антигенами, которое определяется меченой ФИТЦ-антиглобулиновой сывороткой (иммунная сыворотка, конъюгированная с флюоресцеинизотиоцианатом — ФИТЦ).

Посуда и оборудование.

1. Предметные и покровные стекла.
2. Чашки Петри.
3. Центрифуга.
4. Люминесцентный микроскоп (МЛ-2, МЛ-3, «Люмам»).

Реактивы.

1. Антигаммаглобулиновая сыворотка, меченная ФИТЦ.
2. Нефлюоресцирующее иммерсионное масло.
3. Фосфатный буфер рН 7,2—7,4 : 0,53 г однозамешенного фосфата калия, 0,95 г двузамещенного фосфата калия, 8,75 г хлорида натрия на 1 л дистиллированной воды.
4. Печеночный порошок (для специфической адсорбции).
   У обескровленного животного извлекают печень и прополаскивают ее в изотоническом растворе хлорида натрия, разрезают на мелкие кусочки и растирают в фарфоровой ступке с кварцевым песком. Полученную массу заливают двойным объемом 0,87 % раствора хлорида натрия и добавляют 4 объема ацетона (по отношению к полученной смеси). Смесь интенсивно взбалтывают 3—5 мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок промывают изотоническим .раствором хлорида натрия до исчезновения гемоглобина в надосадочной жидкости. Осадок снова разбавляют двумя объемами изотонического раствора и четырьмя объемами ацетона. После отстаивания материала надосадочную жидкость вместе с гомогенатом печени сливают, отделив его от кварцевого песка, а после дополнительного отстаивания сливают надосадочную жидкость. Оставшийся осадок гомогената заливают четырьмя объемами ацетона и фильтруют через воронку Бюхнера с бумажным фильтром. Высушивание порошка проводят в стерильных чашках, прикрытых фильтровальной бумагой, в течение 18 ч при 37 °С. Высушенный материал растирают в ступке, просеивают через мелкое сито и расфасовывают. Предпочтительнее использовать пенициллиновые флаконы, которые после заполнения порошком закупоривают резиновыми пробками и заливают парафином. Порошок сохраняет способность устранять неспецифическую люминесценцию в течение 3 лет.

Ход определения.

Сыворотку крови больного, получаемую обычным путем, раститровывают забуференным изотоническим раствором хлорида натрия (I ч 0,15 М фосфатного буфера рН 7,4 и 9 ч 0,87 % раствора хлорида натрия)
1 : 5, 1 : 10, 1 : 20, 1 : 40, 1 : 80... и т. д. Последнее разведение сыворотки, при котором еще определяется четко выраженное свечение (не менее 2+), определяется как титр АНФ. Опыт подсказывает необходимость разведения сыворотки до 320—640, в редких случаях концентрация АНФ достигает 1 : 10240.

Приготовление срезов печени.

Печень извлекают из только что забитых крыс или мышей (необходимо отбирать здоровых животных), тут же разрезают на блоки 10х10Х5 мм и помещают в термостат с жидким азотом на 1—2 мин. После этого блоки помещают на столик криостата, камера которого охлаждена до —20 °С. Полученные срезы наносят кисточкой на тщательно вымытые обезжиренные предметные стекла по 3—4 среза на одно стекло. Стекла со срезами могут храниться 1— 2 мес в морозильной камере холодильника и использоваться по мере надобности.

Предметные стекла со срезами печени (если они извлечены из морозильника, необходимо подождать, пока испарится конденсат, т. е. стекло прогреется до комнатной температуры) помещают в фосфатный буфер рН 7,5 на 8—10 мин. Затем их извлекают и дают стечь буферу. На влажные срезы пастеровской пипеткой наслаивают (по капле) разведения сыворотки. Стекла с исследуемой сывороткой на срезах помещают во влажную камеру (чашки Петри с кусочками смоченной ваты) при комнатной температуре на 45 мин, после чего стекла со срезами промывают в течение 10 мин в фосфатном буфере. Излишки буфера на стекле вокруг срезов тщательно промокают фильтровальной бумагой. На влажные срезы наслаивают антисыворотку к IgG человека, меченную ФИТЦ и предварительно истощенную печеночным порошком для исключения фонового свечения, которое связано с взаимодействием нормальных печеночных антител, находящихся, как правило, в небольших титрах в нормальных и патологических сыворотках.

Люминесцирующая (меченная ФИТЦ) сыворотка выпускается в ампулах в лиофилизированном виде. На этикетке ампулы обозначено рабочее разведение препарата. Для употребления сыворотку в ампуле разводят 0,5 мл забуференного изотонического раствора хлорида натрия и затем адсорбируют на печеночном порошке. На 1 мл сыворотки берут 80 мг порошка. Смесь тщательно встряхивают. В течение часа при комнатной температуре периодически через 5—10 мин перемешивают, интенсивно встряхивая. Затем центрифугируют 15 мин при 9000 об/мин. Надосадочную жидкость — адсорбированную сыворотку — отсасывают. При температуре хранения 4 °С сыворотка может быть использована в течение 3—б дней.

Инкубацию срезов с меченой антисывороткой также проводят во влажной камере 45 мин при комнатной температуре. Затем срезы отмывают в фосфатном буфере (удаляют непрореагировавшие белки) в течение 10—15 мин и высушивают на воздухе.

Микроскопирование готовых препаратов производят при возбуждающем ультрафиолетовом облучении с использованием входного светофильтра УФС-3 и окулярного светофильтра ОС-3 в системе масляной иммерсии. Степень свечения оценивают в плюсах (от 4+ до 2+). По характеру свечения различных структурных образований ядра выделяют 4 формы свечения, которые отражают отличные друг от друга антинуклеарные факторы. Дифференциация их имеет диагностическое значение.

Результаты непрямого метода иммунофлюоресценции могут быть учтены при условии соблюдения техники постановки реакции и выполнения контролей на специфичность свечения:

1. наслаивать на срезы сыворотку, истощенную антигеном — ДНК, нуклеопротеином или гистоном;
2. использовать сыворотку с заранее определенными антителами другой специфичности.

Клиническое значение.

Диагностическую информативность имеют концентрация и тип антинуклеарного фактора. Низкие титры АНФ часто определяются при разнообразной патологии и у здоровых доноров. Высокие концентрации характерны для системной красной волчанки (СКВ), хронического активного гепатита (ХАГ), в ряде случаев при ревматоидном артрите с системными проявлениями (РА). При СКВ, как правило, выявляется диффузное свечение ядер, при ХАГ — кольцевидное (или краевое), при PA — крапчатое. Последний тип свечения встречается при исследовании сывороток больных склеродермией. Сочетание высоких концентраций АНФ с гомогенным (диффузным) свечением ядер гепатоцитов и низкими значениями гемолитической активности комплемента характерно для СКВ. Нарастание титра АНФ при динамическом исследовании сыворотки пациента может служить ранним признаком обострения процесса (до появления клинических симптомов) и диктовать необходимость повышения дозы стероидных гормонов.