ГЛАВНАЯ СТРАНИЦА ОБЗОР МЕТОДОВ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ НАЗАД
|
|
|
|
ГЛАВНАЯ СТРАНИЦА ОБЗОР МЕТОДОВ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ НАЗАД |
|
| Реакция торможения миграции агармиграционным тестом |
| Приборы и оборудование |
| Реактивы |
| Ход реакции |
| Реакция торможения миграции лейкоцитов в прямом капиллярном тесте. |
| Клиническое значение |
| Литература |
Подвижность лейкоцитов периферической крови, их миграция к очагам тканевой деструкции, хемотаксис к ауто- и гетероантигенам, перераспределение между лимфоидными органами при стрессорно-адаптивных реакциях являются составляющей компонентой общей системы реактивности, способности к сохранению постоянства внутренней среды.
Сенсибилизированные к определенному антигену лимфоциты резко снижают скорость подвижности в среде, в которую вносят этот антиген. Реакция осуществляется при непосредственном взаимодействии антигенспецифических рецепторов с антигеном, а также через воздействие фактора, ингибирующего миграцию клеток, выделяющегося при контакте со специфическим антигеном. Этот феномен позволяет продемонстрировать органоспецифическую клеточно-опосредованную гиперчувствительность.
3% агар-агар на изотоническом растворе натрия хлорида, забуференном трис-хлоридным буфером рН 7,3, охлажденном до 50 °С, добавляют к 10 мл смеси: 9 мл среды 199,1 мл сыворотки крупного рогатого скота, 3000 ЕД мономицина (смесь предварительно прогревают до 37 °С). Полученный гель разливают в чашки (если используются стеклянные, то их необходимо силиконировать), установленные строго горизонтально в количестве, необходимом для создания слоя толщиной 2 мм. В затвердевшем геле пробивают лунки (2,5 мм) в количестве, обусловленном опытом. Концентрацию антигена, которую необходимо внести в смесь, высчитывают опытным путем (по дозе, вызывающей наименьший разброс в повторных постановках) для каждого антигена и серии опытов. Выделение лейкоцитов. В пробирку помещают 10 мл гепаринизированной крови обследуемого (25 ЕД гепарина на 1 мл крови). В течение 1 ч пробирку выдерживают в термостате 37 °С под углом 45°. Через 50 мин пробирки переводят в вертикальное положение и выдерживают еще 10 мин. После отстаивания плазму осторожно отсасывают и переносят в центрифужную пробирку. Центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют. Примесь эритроцитов в клеточном осадке лизируют в гипотоническом растворе хлорида натрия, для чего к клеточному осадку добавляют 5 мл 0,35 % раствора и осторожно пастеровской пипеткой ресуспендируют клетки, не допуская образования пены, в течение 30—45 с. После экспозиции к суспензии клеток немедленно добавляют 0,6 мл 5 % раствора хлорида натрия и тщательно перемешивают. В результате раствор становится изотоничным. Полученную взвесь лейкоцитов трижды отмывают средой 199 или фосфатным буфером рН 7,4.
Контрольные и опытные исследования проводят в 4 параллельных лунках, внося в каждую из них по 5 мкл ресуспендированной лейковзвеси (1,5 млн. клеток). Через 20 ч инкубации чашек в термостате при 37 °С их заливают 10 % раствором формалина (в целях фиксации клеток). Через 4 ч слой агара осторожно удалают, чашки промывают и высушивают. Результаты учитывают путем проектирования полей миграции на бумагу с помощью аппарата «Микрофот». Индекс миграции (И) определяют по расчету соотношения величин площадей миграции в опыте и контроле по формуле:
где Д20 — средний диаметр 4 зон миграции в опыте; Д2К — средний диаметр 4 зон миграции в контроле; д20 — средний диаметр 4 центральных лунок в опыте; д2К — средний диаметр 4 центральных лунок в контроле.
| Реакция торможения миграции агармиграционным тестом |
| Приборы и оборудование |
| Реактивы |
| Ход реакции |
| Реакция торможения миграции лейкоцитов в прямом капиллярном тесте. |
| Клиническое значение |
| Литература |
Выделение лейкоцитов проводят аналогично описанному выше. Выделенные лейкоциты ресуспендируют в 0,1 мл среды 299 или фосфатного буфера. Этой клеточной взвесью заполняют стеклянные капилляры с внутренним диаметром 0,7 мм и длиной 12 см (капилляры необходимо точно калибровать, так как от этого зависит стандартизация объемов клеточной взвеси). С одного конца капилляр запаивают и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин. Концы капилляров, содержащие клетки, нарезают кусочками по 5— 6 мм и погружают в стеклянные камеры, заполненные средой 199, закрепляя их в центре с помощью вазелина, предварительно нанесенного на дно камеры. Камеру герметически закрывают (притирают с вазелином) покровным стеклом и помещают в термостат при 37 °С на 20 ч в строго горизонтальном положении. Оба конца капилляра открыты (камеры готовят из стеклянных колец 20Х10Х2 мм, фиксированных на предметных стеклах смесью воск-парафин). Концентрацию вносимого антигена рассчитывают экспериментально и определяют в мкг/мл по концентрации белка. На каждую концентрацию антигена и контроль используют по 2 капилляра и соответственно получают 4 зоны миграции. Измерение зон миграции, исчисление их площади проводят различными способами. Наиболее распространен метод проектирования чашек (камер) с мигрирующими лейкоцитами, образующими облачко над капилляром, с использованием фотопроектора на миллиметровую бумагу или фотопленку. Проекцию зоны миграции обводят карандашом и высчитывают планиметром или (при использовании рентгеновской пленки) вырезают и взвешивают. Индекс миграции (И) определяют по формуле:
Приготовление и очистка антигенов достаточно полно отражены в ряде руководств (см. рекомендованную литературу).
Выявление сенсибилизированных к определенному антигену лимфоцитов говорит об участии этого антигена в развитии специфической гиперчувствительности и в ряде случаев может быть использовано в диагностике опухолей, гломерулонефрита, дифференциальной диагностике неспецифических миокардитов и кардиопатий.
