ГЛАВНАЯ СТРАНИЦА ОБЗОР МЕТОДОВ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ НАЗАД
|
|
|
|
ГЛАВНАЯ СТРАНИЦА ОБЗОР МЕТОДОВ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ НАЗАД |
|
Полиморфноядерные лейкоциты, моноциты периферической крови способны связывать на своей поверхности, поглощать и переваривать микробную тест-культуру.
Обычно используют стафилококк штамма 209. Однако он практически не подвергается внутриклеточному перевариванию и исключает прямое изучение этой функции фагоцитоза. Мы рекомендуем использовать штамм 9198.
В стерильную пробирку с заранее внесенным раствором 0,6 мл гепарина (G. center), разведенного 1 : 10, вносят 10 мл крови из кубитальной вены. Кровь тщательно перемешивают и центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин. Плазму вместе со слоем лейкоцитов осторожно отсасывают и помещают в чистую центрифужную пробирку, добавляя 5— 6 мл среды 199. Лейкоциты отмывают центрифугированием 10 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют, а находящиеся в осадке лейкоциты ресуспендируют в среде 199 дважды, каждый раз повторяя процедуру «мягкого» центрифугирования. После последнего центрифугирования пипеткой отсасывают надосадочную жидкость и часть клеточной взвеси, оставив в центрифужной пробирке 0,2 мл (10Х106 кл/мл) клеточной взвеси в среде 199. С косого агара с суточной культурой стафилококка стерильным изотоническим раствором натрия хлорида смывают колонии микробов. Используя стандарт оптической мутности, разводят микробную взвесь до концентрации 1 млрд. микробных клеток в 1 мл; 0,3 мл этой взвеси вносят в пробирку, содержащую 0,2 мл лейкоцитов в среде 199, и добавляют 0,15 мл пула свежих донорских сывороток AB(1V) группы (для опсонизации). Осторожным ротированием перемешивают компоненты и термостатируют 30 мин при 37 °С. По истечении указанного времени в пробирку добавляют 5 мл прогретого до 37 °С изотонического раствора натрия хлорида, встряхивают и центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин. По окончании центрифугирования надосадочную жидкость удаляют и делают мазки из лейкоцитарной взвеси, остатки которой вновь помещают в термостат при 37 °С для продолжения инкубации еще в течение 90 мин. Затем мазки приготавливают повторно из осадка двухчасовой инкубации.
Мазки готовят как обычно, на тщательно вымытых обезжиренных предметных стеклах. Каплю лейкоцитарной взвеси помещают недалеко от края стекла и шлифованным предметным стеклом, поставив его под углом 45° к поверхности впереди капли и подождав, пока капля равномерно распределится вдоль его ребра, легким быстрым движением проводят вперед, не отрывая от предметного стекла раньше, чем иссякнет вся капля.
Правильно сделанный мазок имеет равномерно матовый оттенок, не достигает краев стекла и заканчивается остроконечными язычками.
Приготовленные мазки сушат на воздухе, затем фиксируют 10 мин в абсолютном метиловом спирте и красят по Романовскому—Гимзе азур-эозином.
Состав готового красителя: азур II — 3 г, водорастворимый желтый эозин — 0,8 г, метиловый спирт — 250 мл и глицерин — 250 мл. Для окраски мазков берут 2 капли основного раствора красителя на 1 мл дистиллированной воды.
Можно готовить краску непосредственно перед окрашиванием мазков из азура II, эозина и дистиллированной воды в соотношении 3:2:5. На один мазок наслаивают 3 мл раствора красителя. Длительность окраски 45—50 мин.
После окрашивания мазки просматривают под микроскопом в иммерсионной системе (считают не менее 200 клеток) и производят расчет показателей фагоцитоза.
1. Фагоцитарный индекс (ФИ) — процент клеток, вступивших в фагоцитоз, от общего их числа.
2. Фагоцитарное число (ФЧ) — среднее число бактерий, находящихся внутриклеточно (частное от деления общего числа поглощенных бактерий на число клеток, вступивших в фагоцитоз).
3. Оба показателя рассчитывают на мазках, сделанных после 30- и 90-минутной (т. е. в общей сложности 120-минутной) инкубации, иными словами, речь идет о ФИЗО и ФИ120, соответственно ФЧЗО и ФЧ120.
4. Коэффициент фагоцитарного числа:
5. Индекс бактерицидности нейтрофилов:
где Чу — число убитых внутри фагоцитов микробов; Vn — общее число поглощенных фагоцитами микробов.
6. Опсонический индекс поглощения:
Изучение показателей фагоцитоза имеет значение в комплексном анализе диагностики иммунодефицитных состояний: часто рецидивирующие гнойные воспалительные процессы, длительно не заживающие раны, склонность к послеоперационным осложнениям. Помогает в диагностике вторичных иммунодефицитных состояний, вызванных лекарственной терапией. В связи с тем что фагоциты участвуют в элиминации иммунных комплексов и активность фагоцитоза тесно связана с активностью компонентов комплемента, а именно Сз, концентрацией IgG антител, наличием других опсонирующих факторов, исследование фагоцитоза играет роль в диагностике, оценке активности и эффективности терапии при ревматических болезнях, коллагенозах.
Наиболее информативным для оценки фагоцитарной активности следует считать индекс поглощения, т. е. фагоцитарное число, коэффициент фагоцитарного числа, которые отражают завершенность фагоцитоза и индекс бактерицидности — способность фагоцита переваривать захваченный микроб. Особое значение в выявлении причин изменений фагоцитарной активности имеет определение опсонического индекса поглощения, так как он характеризует наличие сывороточных факторов, сопутствующих миокардитам, ревматизму, ревматоидному артриту и др., способных изменить активность иммунокомпетентных и фагоцитирующих клеток.
