Определение цитоплазматического маркера

Реактивы

1. параформальдегид 4% (срок хранения 4 недели при 4^оС)*;
2. тритон 1%;
3. моноклональные антитела (MPO, TdT, IgM, CD3, СD22, отрицательный контроль);
4. вторые антитела с ФИТЦ;
5. фосфатно-забуференный физ.раствор – ЗФФР, рН 7.2-7,4;
6. глицерин с физ.раствором (для иммерсии);
7. полилизин (для обработки стекол).

*-параформальдегид – приготовление: 200 мг параформальдегида + 5 мл ЗФФР, инкубация в течение 18-24 часов при 56^оС;

 

№	Этап исследования	Объем	Время
1.	Маркировка микропробирок и запись панели (перечня) МКАТ в рабочий журнал
2.	Приготовление 1% раствора формальдегида (0,5 мл 4% раствора формальдегида + 1,5 мл физ.раствора)
3.	Внесение 1% раствора параформальдегида в каждую микропробирку	1 мл
4.	Внесение и ресуспендирование МФ с параформаль-дегидом	50 мкл*
5.	Инкубация при 4° С		30 мин
6.	Внесение 1% тритона с ресуспендированием	50 мкл
7.	Инкубация при 4° С		10 мин
8.	Однократная отмывка клеток в ЗФФР	1000 об/мин	10 мин
9.	Внесение первых АТ с ресуспендированием		60 мин
10.	Инкубация при 4° С
11.	Однократная отмывка	в1 мл ЗФФР	10 мин
10.	Внесение вторых АТ с ресуспендированием
11.	Инкубация при 4° С		30 мин
12.	Подготовка стекол (нанесение поли-L-лизина, и инкубация при 37° С в течение 30 мин)	25 мкл
13.	Двукратная отмывка	в1 мл ЗФФР	по 10 мин
14.	Разведение, внесение и тщательное перемешивание 30% глицерина (глицерин с ЗФФР) с клетками	20 мкл