МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ  

ГЛАВНАЯ СТРАНИЦА     ОБЗОР МЕТОДОВ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ     НАЗАД    

 

Выделение мононуклеарной фракции крови и костного мозга по методу Boyum (Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow //Scand.J.Clin.Lab.Investig.-1968.-Vol.21-Suppl.97.p.1-9)

Принцип метода

Принцип метода основан на различии в плавучей плотности форменных элементов крови. Смесь полисахарида фиколла и рентгеноконтрастного вещества изопак или верографин создает градиент с такой плотностью, которая позволяет при центрифугировании разделить клетки периферической крови и костного мозга на мононуклеарную фракцию (МФ), в которую входят лимфоциты, субпопуляция моноцитов и бластные гемопоэтические клетки, и фракцию, содержащую гранулоциты и эритроциты. МФ обладают меньшей, чем градиент, плотностью и располагаются над градиентом. Плотность гранулоцитов и эритроцитов больше, чем плотность градиента, они проходят через градиент, опускаясь на дно пробирки.

Методика МФ выделяют из гепаринизированной крови или костного мозга (7-10 МЕ гепарина/мл для крови и 20 МЕ гепарина/мл для костного мозга). Костный мозг разводят физиологическим раствором (рН 7,2) в соотношении 1:5; кровь, в соотношении 1:2 или 1:3. Разведенную физиологическим раствором кровь или костный мозг центрифугируют в градиенте плотности фиколл-верографин (Pharma cia Fine Chemicals, Швеция), плотность 1,077 г/мл (Хейфиц Л.Б., Абалкин В.А. Разделение форменных элементов крови человека в градиенте плотности верографин-фиколл //Лаб.дело, 1973.-10.-с.579-581) при 400g в течение 30 мин. Полученную МФ трижды отмывают в ЗФФР (физиологический раствор, забуференный с помощью фосфатно-солевого буфера) и ресуспендируют в среде RPMI-1640 (Flow Laboratories, Англия) в концентрации 106 клеток в мл. Жизнеспособность клеток, определяемая по методу окрашивания с трипановым синим (Ланг Н.Р. Стимуляция лимфоцитов //М.:Медицина, 1976.-288 с.) превышает 96%.

 

 

Выявление поверхностных антигенов на иммунокомпетентных и гемопоэтических клетках с помощью моноклональных антител (МКАТ) в методе непрямой иммунофлуоресценции (модификация метода Coons et al., 1955)

Принцип метода

Принцип метода основан на выявлении поверхностных антигенов посредством взаимодействия с антителами, получаемые с помощью гибридомной технологии и направленные к детерминанте одного белка клеточной поверхности. Отличительной особенностью МКАТ является их постоянный состав. Визуализация взаимодействия МКАТ и клеточных антигенов осуществляется посредством вторых антител, реагирующих с g -глобулинами животного, донора первых антител, например кроличьи антитела (второй слой) к g -глобулинам белой мыши (первые специфические антитела), меченных флуоресцентной меткой (ФИТЦ). Оценка результатов производится по свечению клеток в люминисцентном микроскопе.

Достоинства метода

  1. С каждой молекулой первого (специфического) антитела могут связаться две меченые молекулы антииммуноглобулинов, что увеличивает чувствительность метода по сравнению с прямым методом.
  2. Экономичность. Один препарат флуоресцентных антител второго слоя может быть использован для окрашивания множества первых антител, взаимодействующих с разнообразными антигенами; необходимо только, чтобы все они были получены при использовании животных одного вида, а именно того, к IgG которого специфичны антитела второго слоя. Помимо флуоресцеина используют и другие метки, например родамин, флуоресцирующий в оранжево-красной области, однако интенсивность свечения у него ниже, чем у ФИТЦ. Родамин обычно используют при окрашивании по двум антигенам одновременно.

Условия, необходимые для проведения иммунофенотипирования

  1. Сохранность антигена (определение жизнеспособности клеток в клеточной суспезии).
  2. Специфичность окрашивания (отсутствие неспецифического связывания).
  3. Хорошо охарактеризованный препарат антител.
  4. Удобная метка.

 

Специфичность реакции и основные контроли.

Для того, чтобы убедиться в достоверности положительного результата, полученного при иммунофенотипи-ровании, необходимо исключить возможность неспецифических реакций (табл.1 и 2).

Таблица 1.
Основные контроли

Контроли на реактивы
1. В каждом исследовании необходимо проводить окрашивание заведомо положительного общелейкоцитарного антигена, например CD45.
2. Проверка окрашивания, полученного на исследуемых клетках:
  1. в качестве первого слоя наносят неиммунную сыворотку;
  2. сыворотку, заведомо не взаимодействующую с клетками;
  3. первый слой опускают.

Результаты окрашивания должны быть отрицательными.

Контроли на специфичность антител
3. МКАТ должны работать в максимальном разведении, указанном в инструкции.

Таблица 2.
Неспецифическое окрашивание: методические трудности и пути их преодоления

Непрямой иммунофлуоресцентный метод
Методические трудности Пути преодоления
Сильная фоновая флуоресценция
  1. Использовать более высокие разведения первых и/или вторых антител.
  2. До нанесения первых антител провести блокирование нормальной сывороткой животного, донора вторых антител.
  3. Удалить свободный флуоресцеинизоцианат с помощью хроматографии на колонке с сефадексом G-50 (иногда возможно осаждение при центрифугировании 400g).

Методика иммунофенотипирования

4 часа 50 мин на 1 исследование (время врача-лаборанта – 2 часа 25 мин). 7 микропробирок - для специфической реакции и 2 - для контролей.

№ Этап исследования Время
1. Маркировка микропробирок и запись панели (перечень) МКАТ в рабочий журнал 5 мин
2. Внесение суспензии МФ в каждую микропробирку 25 мкл 5 мин
3. Внесение нормальной кроличьей сыворотки* с ресуспензией 10 мкл 5 мин
4. Инкубация при 37° С 20 мин
5. Внесение первых МКАТ, ресуспензия 5 - 10 мкл 10 мин
6. Инкубация при 4° С 30 мин
7. Однократная отмывка клеток в ЗФФР** 5 мин
8. Внесение нормальной кроличьей сыворотки с ресуспензией 10 мкл 5 мин
9. Инкубация при 4° С 5 мин
10. Подготовка стекол (нанесение поли-L-лизина, и инкубация при 37° С в течение 30 мин) 25 мкл 5 мин
11. Разведение и внесение вторых антител*** с ресуспензией 20 мкл 10 мин
12. Инкубация при 4° С 30 мин
13. Двукратная отмывка клеток в ЗФФР по 5 мин 20 мин
14. Разведение, внесение и тщательное перемешивание 30% глицерина (глицерин с ЗФФР) с клетками 20 мкл 10 мин
15. Помещение клеток на подготовленное стекло**** 10 мин
16. Инкубация клеток на стекле во влажной камере при 4° С 30 мин
Оценка результатов
1. Подготовка люминисцентного микроскопа (проверка центровки лампы, чистоты оптики и т.п.) 5 мин
2. Просмотр и подсчет***** препаратов, запись в рабочий журнал, 60 мин
*- нормальная кроличья сыворотка (пул сывороток от здоровых кроликов для блокирования Fc-рецепторов) инактивированная при 56° С в течение 30 мин, хранить при -20° С;
**- фосфатно-забуференный физ.раствор (ЗФФР) 0,1 М рН 7,2-7,4:
№ 1. Na2HPO4 * 12H2O высушенный при 37оС – 35,8 г на 1 л дист.воды,
17,9 г на 0,5 л дист.воды,
8,95 на 0,25 л дист.воды,
№ 2. КH2PO4 *2H2 O - 13,6 г на 1 л дист.воды,
6,8 г на 0,5 л дист.воды,
3,4 г на 0,25 л дист.воды
0,2 л раствора №2 постепенно приливать в раствор №1 + азид натрия
(конечная концентрация 0,01%).

*** - вторые антитела - антитела против g -глобулинов белой мыши (донор первых специфических МКАТ) меченные флуоресцеином;
****- клетки наносить на влажную поверхность лунки (стекло после инкубации с поли-L-лизином помещают в стаканчик с ЗФФР за 5 мин до использования);
***** - считать не менее 200 клеток, сопоставляя фазовоконтрастную (световую) и люминисцентную картину каждого поля зрения для определения процентного содержания клеток с меткой.

 

 

Скрининговая панель моноклональных антител для оценки иммунного статуса

  Субпопуляция клеток Клеточный антиген Каталожный номер DAKO 1997
Т-лимфоциты CD3 M 0780
Т-хелперы, субпопуляция моноцитов CD4 M 0716
Цитотоксические Т-лимфоциты CD8 M 0707
Рецептор ИЛ2 CD25 M 0731
В-лимфоциты CD20 M 0774
EK (НК-клетки) CD56 M 7074
Моноциты CD14 M 0825
В-лимфоциты, моноциты, активированные Т-лимфоциты HLA DR M 0775
Положительный контроль CD45 M 7150
Отрицательный контроль Mouse IgG1 X 0931
Вторые антитела Rabbit-Anti-Mouse Immunoglobulins/ FITC
Rabbit F(ab’)2		 F 0313

 

НАЗАД           ВВЕРХ      

 

Hosted by uCoz