Метод Зингера (Singer et al., 1951 ].

Принцип.

Определение основано на щелочеустойчивости гемоглобина F; с помощью щелочи проводят денатурацию гемоглобина А, а F определяют спектроскопически.

Реактивы.

1. Раствор едкого натра 1/12 н. (рН 12,7); хранят в парафинированном сосуде в холодильнике.
2. Раствор сульфата аммония:
   к 350 г аммония (NH₄)₂SO₄ добавляют 500 мл дистиллированной воды, дают постоять и смешивают 400 мл  этого раствора с равным   объемом дистиллированной воды. Затем к 800 мл полунасыщенного раствора  добавляют 2 мл 10 н. НСl.
3. 5 % раствор цитрата натрия.

Специальное оборудование.

Спектрофотометр.

Ход определения.

Приготовление гемоглобинового раствора — гемолизата:

0,2—1 мл исследуемой крови помещают в пробирку с 3 мл 5 % раствора цитрата натрия, перемешивают и центрифугируют в течение 5 мин при 3000 об/мин. Верхний слой отсасывают и повторно 2—3 раза отмывают эритроциты с центрифугированием до полного обесцвечивания надосадочного слоя. Затем добавляют к осадку равный объем дистиллированной воды, хорошо перемешивают, центрифугируют 15—20 мин при 6000 об/мин. Отобранный верхний слой исследуют. Гемолизат можно хранить в холодильнике несколько недель.

В 1 мл дистиллированной воды разводят 0,2 мл гемолизата с приблизительной концентрацией 10 г% (100 г/л). Определяют общее содержание гемоглобина (А + F) на спектрофотометре при длине волны 541 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.

Для изоляции гемоглобина F в пробирку с 3,2 мл 1/12 н. раствора едкого натра, предварительно помещенную в водяную баню на 10 мин при 20 °С, быстро вливают 0,2 мл гемолизата, сильно взбалтывают в водяной бане в течение 10 с, затем включают секундомер. Через 1 мин добавляют 6,8 мл раствора сульфата аммония. Смесь хорошо перемешивают, переворачивая пробирку до 6 раз, и затем фильтруют через двойной слой обеззоленных фильтров. На фильтре остается гемоглобин А, а фильтрат содержит гемоглобин F, который определяют спектроскопически в тех же условиях, что и раствор общего гемоглобина.

Проводят также и «холостой» опыт — определяют экстинкцию смеси 3,2 мл 1/12 н. едкого натра, 6,8 мл раствора сульфата аммония и 0,2 мл воды.

Расчет проводят по формуле:

, где
E₁ — экстинкция общего раствора гемоглобина; E₂ — экстинкция раствора гемоглобина F; E₃ — экстинкция «холостой» пробы.

Менее точное представление о содержании гемоглобина F дает цитохимическое исследование (метод Ветке) (см. 3.3.9).

Клиническое значение.

Повышение гемоглобина F является важным критерием для диагностики b-талассемии, при которой одновременно повышается и содержание гемоглобина А2. Особенно высокие цифры гемоглобина F могут быть при гомозиготной b-талассемии до 20—90 %. При гетерозиготной b-талассемии содержание гемоглобина F может быть нормальным или умеренно повышенным (2,5—7%).

Однако надо иметь в виду, что повышение гемоглобина F не является специфичным для Р-талассемии. Оно встречается при различных формах малокровия: других гемолитических анемиях, железодефицитной анемии, гипопластической анемии, лейкозах и других состояниях, сопровождающихся гипоксией. Возможно, что повышение гемоглобина F при этих заболеваниях развивается компенсаторно.

Гемоглобин А2 отличается от гемоглобина А более медленной миграцией при электрофорезе, на этом основаны методы его определения. Химическая структура полипептидных цепей глобина у гемоглобина А2 характеризуется наличием двух цепей а и двух цепей 6 (a2, б2). Исследование гемоглобина А2 наиболее информативно при использовании электрофореза на ацетатцеллюлозе (см. исследование белков).

Повышение содержания гемоглобина А2 характерно для b-талассемии; при гетерозиготной форме болезни содержание Аг составляет 4,2—8,9 %.

Литература.

• Kunkel Н. G., Wallenius G— Sciense, 1955, vol. 122, р. 288;
• Singer К; Chernoff A., Singer L— Blood, 1951, vol. 6, p. 413; Vella F— Nature, 1959, vol. 184, p. 272.